利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建Drosha、XRCC6、RNaseL基因編輯細(xì)胞系.pdf

1、近年來(lái)鋅指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effect nucleases，TALEN）技術(shù)和成簇的規(guī)律性間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated，CRISPR/Cas）系統(tǒng)等基因編輯技術(shù)的發(fā)展

2、為在生物體內(nèi)和細(xì)胞中對(duì)基因組進(jìn)行編輯和基因功能研究提供了簡(jiǎn)便高效的技術(shù)方法。CRISPR/Cas作為一種最新型基因編輯工具，可以高效地在內(nèi)源環(huán)境中選擇性的改變機(jī)體基因組DNA的功能，其為在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等方面的研究提供了條件。本文利用該系統(tǒng)在HEK293細(xì)胞分別敲除Drosha基因和RNaseL基因，以及在HeLa細(xì)胞的XRCC6（X-ray complementing defective repair in chinese hamste

3、r cells6）基因C末端插入Flag標(biāo)簽，對(duì)上述三種基因分別進(jìn)行了基因編輯并篩選獲得穩(wěn)定細(xì)胞系。
　　本研究首先在HEK293細(xì)胞中對(duì) Drosha基因進(jìn)行了敲除，利用基因敲入的方法，在Drosha基因的起始密碼子處插入一段帶有終止密碼子的潮霉素抗性基因序列，破壞Drosha蛋白的編碼框，從而使Drosha基因不表達(dá)，并且潮霉素B抗性基因序列的成功插入的細(xì)胞株獲得潮霉素 B抗性，從而提高了篩選效率。根據(jù)GenBank中 Dro

4、sha基因序列，設(shè)計(jì) Drosha敲除的 sgRNA序列，將其克隆到pCas-Guide真核表達(dá)載體中，獲得pCas-sgRNA載體；設(shè)計(jì)供體DNA的同源臂序列，通過(guò)搭橋PCR將左同源臂、潮霉素B抗性基因和右同源臂擴(kuò)增成為一條片段作為同源重組的修復(fù)模板，并將其克隆到 pBackZero-T表達(dá)載體上，獲得pBackZero-T-Drosha載體。將上述兩個(gè)載體共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，用潮霉素B篩選，通過(guò)western blot和DNA測(cè)

5、序等技術(shù)驗(yàn)證Drosha從基因組上敲除。本研究利用同樣的方法在HEK293細(xì)胞中敲除了RNase L基因，獲得5株RNase L完全敲除細(xì)胞株，并檢測(cè)了敲除RNase L基因?qū)EK293細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響。
　　除了敲除基因外，本研究使用 CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行了插入標(biāo)簽序列的基因編輯研究。在HeLa細(xì)胞中，在XRCC6基因C末端插入Flag標(biāo)簽序列。根據(jù)GenBank中XRCC6基因序列，設(shè)計(jì)XRCC6基因敲入

6、的sgRNA序列，將sgRNA片段構(gòu)建入pCas-Guide載體中，獲得載體pCas-XRCC6；設(shè)計(jì)XRCC6基因的同源臂序列，利用搭橋PCR方法將同源臂和Flag標(biāo)簽序列作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到donor DNA片段，并將該片段克隆到 pBackZero-T載體上，獲得 pXRCC6-Donor載體。將上述兩個(gè)載體共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，在蛋白水平上進(jìn)行初步檢測(cè)，根據(jù)western印跡結(jié)果，選擇 Flag標(biāo)簽序列插入效率最高 HeLa細(xì)胞

7、進(jìn)行下一步穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選，從而減少工作量。然后再采用PCR、western印跡等方法篩選出Flag標(biāo)簽序列插入到XRCC6基因C末端的細(xì)胞株。獲得表達(dá)XRCC6-Flag標(biāo)簽融合蛋白細(xì)胞系，為XRCC6與其它蛋白或RNA的相互作用和功能研究提供了細(xì)胞模型。
　　本研究采用CRISPR/Cas9技術(shù)成功地對(duì)Drosha/XRCC6/RNase L基因分別進(jìn)行了編輯，篩選獲得了基因編輯的穩(wěn)定細(xì)胞系，為深入開(kāi)展基因功能研究提供了條件。