利用CRISPR-Cas9技術構建Drosha、XRCC6、RNaseL基因編輯細胞系.pdf

1、近年來鋅指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）技術、轉(zhuǎn)錄激活因子效應物核酸酶（transcription activator-like effect nucleases，TALEN）技術和成簇的規(guī)律性間隔的短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated，CRISPR/Cas）系統(tǒng)等基因編輯技術的發(fā)展

2、為在生物體內(nèi)和細胞中對基因組進行編輯和基因功能研究提供了簡便高效的技術方法。CRISPR/Cas作為一種最新型基因編輯工具，可以高效地在內(nèi)源環(huán)境中選擇性的改變機體基因組DNA的功能，其為在生物學和醫(yī)學等方面的研究提供了條件。本文利用該系統(tǒng)在HEK293細胞分別敲除Drosha基因和RNaseL基因，以及在HeLa細胞的XRCC6（X-ray complementing defective repair in chinese hamste

3、r cells6）基因C末端插入Flag標簽，對上述三種基因分別進行了基因編輯并篩選獲得穩(wěn)定細胞系。
　　本研究首先在HEK293細胞中對 Drosha基因進行了敲除，利用基因敲入的方法，在Drosha基因的起始密碼子處插入一段帶有終止密碼子的潮霉素抗性基因序列，破壞Drosha蛋白的編碼框，從而使Drosha基因不表達，并且潮霉素B抗性基因序列的成功插入的細胞株獲得潮霉素 B抗性，從而提高了篩選效率。根據(jù)GenBank中 Dro

4、sha基因序列，設計 Drosha敲除的 sgRNA序列，將其克隆到pCas-Guide真核表達載體中，獲得pCas-sgRNA載體；設計供體DNA的同源臂序列，通過搭橋PCR將左同源臂、潮霉素B抗性基因和右同源臂擴增成為一條片段作為同源重組的修復模板，并將其克隆到 pBackZero-T表達載體上，獲得pBackZero-T-Drosha載體。將上述兩個載體共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，用潮霉素B篩選，通過western blot和DNA測

5、序等技術驗證Drosha從基因組上敲除。本研究利用同樣的方法在HEK293細胞中敲除了RNase L基因，獲得5株RNase L完全敲除細胞株，并檢測了敲除RNase L基因?qū)EK293細胞增殖、周期和凋亡的影響。
　　除了敲除基因外，本研究使用 CRISPR/Cas9技術進行了插入標簽序列的基因編輯研究。在HeLa細胞中，在XRCC6基因C末端插入Flag標簽序列。根據(jù)GenBank中XRCC6基因序列，設計XRCC6基因敲入

6、的sgRNA序列，將sgRNA片段構建入pCas-Guide載體中，獲得載體pCas-XRCC6；設計XRCC6基因的同源臂序列，利用搭橋PCR方法將同源臂和Flag標簽序列作為模板進行擴增，得到donor DNA片段，并將該片段克隆到 pBackZero-T載體上，獲得 pXRCC6-Donor載體。將上述兩個載體共轉(zhuǎn)染HeLa細胞，在蛋白水平上進行初步檢測，根據(jù)western印跡結果，選擇 Flag標簽序列插入效率最高 HeLa細胞

7、進行下一步穩(wěn)定細胞株的篩選，從而減少工作量。然后再采用PCR、western印跡等方法篩選出Flag標簽序列插入到XRCC6基因C末端的細胞株。獲得表達XRCC6-Flag標簽融合蛋白細胞系，為XRCC6與其它蛋白或RNA的相互作用和功能研究提供了細胞模型。
　　本研究采用CRISPR/Cas9技術成功地對Drosha/XRCC6/RNase L基因分別進行了編輯，篩選獲得了基因編輯的穩(wěn)定細胞系，為深入開展基因功能研究提供了條件。