p53誘導基因Unc5H4在神經(jīng)母細胞瘤發(fā)生發(fā)展的作用機制.pdf

1、本研究將進一步證實Unc5H4可作為新型的具有獨立預后指示作用的神經(jīng)母細胞瘤標志物。 良性神經(jīng)母細胞瘤中有高Unc5H4.表達的現(xiàn)象提示該基因具有誘導腫瘤細胞凋亡的功能，而p53是已知的重要腫瘤抑制基因，在人類半數(shù)以上腫瘤中均有p53基因的突變[7]。在致癌因素存在時，細胞通過轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平激活內(nèi)源性p53的表達，而上調(diào)的p53又反過來在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)具有p53結(jié)合位點的目的基因的表達從而發(fā)揮腫瘤抑制作用。本研究致力于Unc5H

2、4的條件性腫瘤抑制功能與p53關系的研究，以期發(fā)現(xiàn)新型p53誘導基因及凋亡信號傳導途徑。 人體是復雜的有機整體，發(fā)育中基因表達的多樣性，信號傳導通路的錯綜復雜使神經(jīng)母細胞瘤的研究更加深奧。依賴性受體和條件性腫瘤抑制基因的概念是近年研究的重大發(fā)現(xiàn)，而在神經(jīng)母細胞瘤中發(fā)現(xiàn)和證實該種基因的存在為進一步揭示神經(jīng)母細胞瘤的特殊生物學行為提供了全新和深入的理論依據(jù)，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生發(fā)育過程中，Unc5H家族成員在有Netrin-1蛋白分泌區(qū)域

3、能夠誘導神經(jīng)細胞存活、分化及軸突的延伸，但隨著優(yōu)化篩選后，機體通過抑制Netrin-1蛋白的分泌，而僅依靠Unc5H基因的獨立表達誘導那些未能建立軸突聯(lián)系的神經(jīng)細胞發(fā)生凋亡，凋亡的延遲或消失則導致腫瘤發(fā)生。而神經(jīng)母細胞瘤中p53基因的失活、Unc5H4基因的突變或Netrin-1基因的持續(xù)表達均可造成腫瘤的發(fā)生發(fā)展，重建p53、Unc5H4基因功能，抑制Netrin-1蛋白分泌等在理論上均可抑制神經(jīng)母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展，因而明確Unc5H

4、4所激活的不同信號傳導通路有利于從分子水平揭示神經(jīng)母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展機制，并為在基因水平治療該疾病提供有力的分子生物學基礎。 方法： 一、臨床部分 1、臨床資料：118例原發(fā)神經(jīng)母細胞瘤cDNA，其中良性神經(jīng)母細胞瘤56例，Evans分期屬Ⅰ期、Ⅱ期及ⅣS期，平均生存時間43.8月；惡性神經(jīng)母細胞瘤62例，Evans分期屬Ⅲ期和Ⅳ期，平均生存時間34.7月。全部腫瘤均經(jīng)術中、術后病理及分子生物學標記物確診，患者確

5、診年齡為1月～14歲，平均年齡3.1歲。腫瘤標本均為初發(fā)未治。標本來源于日本千葉縣腫瘤研究所神經(jīng)母細胞瘤標本庫，標本使用符合日本相關法律。 2、RT-PCR：采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術對32例神經(jīng)母細胞瘤cDNA標本中Unc5H4及其家族同系物Unc5H1-3的mRNA進行半定量檢測，以初步明確Unc5H家族成員在良、惡性神經(jīng)母細胞瘤中的表達模式。32例標本中包含16例良性神經(jīng)母細胞瘤、16例惡性神經(jīng)母細胞瘤。以

6、GAPDH為內(nèi)參照。 3、熒光定量實時PCR：118例原發(fā)神經(jīng)母細胞瘤標本cDNA已制備完成。制備標準曲線樣品。標準曲線樣品樣品和待測樣品分別加入到含SG的實時PCR反應液中進行實時PCR擴增和檢測。檢測結(jié)果進行標準曲線分析，對Unc5H4或Unc5H1/3基因進行定量。 4、Kaplan-Meier生存分析：結(jié)合臨床資料及Unc5H4在某一群體中表達模式進行生存分析。 二、基礎部分 1、細胞培養(yǎng)：人骨肉

7、瘤來源U2OS及SAOS2細胞系在DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，人肺癌細胞系H1299及人神經(jīng)母細胞瘤細胞系SH-SY5Y均在RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。培養(yǎng)基中含有10％熱滅火胎牛血清，50U/ml青霉素及50μg/ml鏈霉素；細胞在37℃、5％CO2平衡濃度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞單層生長融合率至80％時傳代或進行實驗。在實驗所設計的時間段用終濃度1μmol/L阿霉素的相應培養(yǎng)基換液處理。 2、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：采用脂質(zhì)體Lipofec

8、tamine2000介導轉(zhuǎn)染技術，在H1299細胞中轉(zhuǎn)染入p53質(zhì)?；?qū)φ湛召|(zhì)粒；在U2OS細胞中轉(zhuǎn)染入siRNAp53質(zhì)?；蚩召|(zhì)粒；在H1299細胞中轉(zhuǎn)入PGL3-p53結(jié)合區(qū)質(zhì)粒和p53質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染方法參照相關轉(zhuǎn)染試劑說明步驟。 3、細胞生存分析：將U2OS、H1299及SH-SY5Y細胞以5×103個細胞/孔分別接種于96孔板中，貼壁過夜，然后暴露于終濃度1μmol/L阿霉素中。在阿霉素處理后的指定時間內(nèi)，加入10μl染色劑

9、，在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)反應1hr，然后放入酶標儀，讀取570nm波長下的O．D．值。 4、RT-PCR：參照試劑盒使用方法，在實驗細胞中通過Rnessy Mini Kit提取總RNA，并用隨機引物和SuperScript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶得到cDNA。經(jīng)PCR擴增的第一鏈來檢驗目的基因的表達水平。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離后，用溴乙錠顯色。 5、蛋白質(zhì)檢測(Western-blotting)：收集細胞經(jīng)冷1×PBS

10、液清洗后在SDS細胞裂解液中裂解。再用蛋白檢測染液測定蛋白濃度，相同蛋白含量的細胞裂解液加樣于10％SDS聚丙烯酰胺電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含0.3％脫脂牛奶的TBS封閉非特異吸附，分別加入一抗抗體室溫作用1hr，洗膜，并用相應二抗作用，在ECL系統(tǒng)顯色。 6、克隆構建實驗：在U2OS和H1299細胞中轉(zhuǎn)染入空質(zhì)粒(pcDNA3)或Unct5H4表達質(zhì)粒(pcDNA3-Unct5H4)48小時后，用400μg/ml G4

11、18的培養(yǎng)基進行14天篩選，耐藥克隆用Giemsa染液染色，記錄克隆數(shù)目。 7、熒光素酶檢測法：H1299細胞以5×104細胞／孔接種于12孔板中貼壁過夜。轉(zhuǎn)染體系包括100ng PGL3-啟動子質(zhì)粒，p53-RE1，p53-RE2，p53-RE3及p53-RE4，10ng Renilla熒光素酶標記結(jié)構及25ng p53-flag表達質(zhì)粒。每一份轉(zhuǎn)染所包含的質(zhì)粒數(shù)為510ng，不足處以pcDNA3質(zhì)粒填充，轉(zhuǎn)染48小時后，裂解

12、細胞并應用雙色熒光素酶檢測系統(tǒng)進行熒光素酶活性的檢測，具體步驟參照試劑盒說明。 8、染色質(zhì)免疫沉淀分析法：在H1299細胞中轉(zhuǎn)染空質(zhì)?；騪53表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48小時后細胞在37℃條件下與含1％甲醛的培養(yǎng)液進行交聯(lián)反應，得到交聯(lián)的染色質(zhì)后超聲將其斷裂為平均長度為200-800的核苷片段，應用脫氧核糖核酸/蛋白質(zhì)A瓊脂糖珠加以反復清洗后，對照使用正常鼠血清、實驗組使用單克隆抗p53抗體進行免疫沉降。沉降物用100μl洗提掖(含1％S

13、DS和1mM碳酸氫鈉)洗提。甲醛介導的脫氧核糖核酸/蛋白質(zhì)交聯(lián)在65℃加熱4小時條件下失效，反應物在45℃下蛋白酶K作用1小時。應用QIAquickPCR純化試劑盒(Qiagen)純化基因組DNA。 9、流式細胞儀檢測凋亡：轉(zhuǎn)染群1和＃3的SAOS2細胞，應用1μg/ml ADR處理48小時，收集包括懸浮細胞在內(nèi)的全部細胞。PBS清洗，-20℃ 70％酒精固定細胞，懸浮于phosphate—citrate液中，室溫放置15分鐘，

14、Propidium Iodido使檢DNA染色，并10μg/ml Rnase A抑制RNA酶作用，暗處反應30分鐘，流式細胞儀檢測細胞DNA含量并應用CellQuest軟件處理數(shù)據(jù)。 結(jié)果： 一、臨床部分 1、Unc5H4在良性神經(jīng)母細胞瘤具有高表達：應用RT-PCR法在16例良性神經(jīng)母細胞瘤cDNA和16例惡性神經(jīng)母細胞瘤cDNA中檢測Unc5H家族成員的表達模式發(fā)現(xiàn)Unc5H1/3/4均在良性神經(jīng)母細胞瘤中有

15、高表達的可能，進而在118例原發(fā)神經(jīng)母細胞瘤cDNA中進行熒光定量實時PCR檢測，結(jié)果顯示Unc5H4在良性神經(jīng)母細胞瘤中較在惡性神經(jīng)母細胞瘤中有高表達，差值有顯著統(tǒng)計學意義，而Unc5H1/3則無此種表達差別。 2、在良、惡性神經(jīng)母細胞瘤中Unc5H4高表達與長期臨床預后相關：在118例神經(jīng)母細胞瘤患兒中，良性56例，平均生存期為43.8月，而惡性神經(jīng)母細胞瘤共62例，平均生存時間為34.7月，統(tǒng)計學處理顯示，高Unc5H4表

16、達與長期生存密切相關。 3、在惡性及有MYCN擴增的神經(jīng)母細胞瘤中，Unc5H4的高表達與腫瘤患兒長期臨床預后相關：同樣結(jié)論在惡性神經(jīng)母細胞瘤及MYCN擴增組神經(jīng)母細胞瘤患兒中均顯示高Unc5H4表達與長期預后相關。證明Unc5H4是一個新型神經(jīng)母細胞瘤的預后指示基因。 二、基礎部分 1、Unc5H4誘導細胞包括神經(jīng)母細胞瘤細胞的凋亡：在U2OS細胞系及SH-SY5Y細胞系細胞中，Unc5H4的表達能誘導細胞發(fā)生

17、凋亡。 2、Unc5H4的功能依賴于正常的p53基因功能：在阿霉素介導的DNA損傷型凋亡中，H1299細胞無p53表達，則其不能誘導Unc5H4的表達且不能誘導克隆形成減少，而含正常p53功能的U2OS細胞增均能實現(xiàn)。此外，在U2OS細胞中敲除p53基因的表達則阻斷了阿霉素誘導凋亡功能和Unc5H4的內(nèi)源性表達。 3、Unc5H4是p53的直接轉(zhuǎn)錄目標基因：在Unc5H4內(nèi)含子1序列中發(fā)現(xiàn)和證實了p53結(jié)合位點的存在。