Mash1基因過(guò)表達(dá)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療癲癇的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、癲癇是發(fā)病率最高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙,表現(xiàn)為慢性、反復(fù)發(fā)作的大腦神經(jīng)元異常放電。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)的數(shù)據(jù)顯示,全球癲癇患者約為五千萬(wàn)至一億,并且全球約5％的人群一生中具有罹患癲癇的風(fēng)險(xiǎn)。癲癇患者中有約30%行藥物治療效果欠佳,而藥物治療之外的手術(shù)治療以及神經(jīng)電刺激治療(迷走神經(jīng)電刺激術(shù)(vagus nerve stimulation,VNS)、腦深部電刺激治療(deep brai

2、n stimulation,DBS))等并不適合于所有癲癇患者特別是無(wú)手術(shù)指征者,因此,有必要尋找更有效、安全、持久的新治療方法。
　　腦內(nèi)伽馬氨基丁酸(gamma-amino butyric acid,GABA)能神經(jīng)元減少會(huì)導(dǎo)致癲癇是目前了解的可能核心機(jī)制。研究顯示,源自不同類別干細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells,ESCs)、神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)、間充質(zhì)干細(xì)胞(m

3、esenchymal stem cells,MSCs)等)的GABA能神經(jīng)元可以抑制癇性發(fā)作、延長(zhǎng)模型動(dòng)物生存期,因此,大量學(xué)者把目光聚焦于基于干細(xì)胞的癲癇治療策略。但細(xì)胞來(lái)源無(wú)法滿足需求成為個(gè)中羈絆。
　　間充質(zhì)干細(xì)胞因具有自我更新和多向分化潛能的特性使其成為細(xì)胞治療策略的優(yōu)良候選細(xì)胞并逐漸成為熱點(diǎn)。作為間充質(zhì)干細(xì)胞中的一員,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone morrow mesenchymal stem cells,BMSCs)來(lái)源

4、于骨髓,它在人體內(nèi)分布廣泛,易于提取、分離,而且在應(yīng)用于自體時(shí)不存在免疫排斥以及倫理學(xué)障礙,有研究顯示BMSCs移植治療可以抑制癲癇動(dòng)物模型的自發(fā)性癇性發(fā)作(spontaneous recurrent seizure,SRS)的頻率。使用其進(jìn)行移植治療并使之與宿主神經(jīng)元形成突觸聯(lián)系幫助其功能重建是有可能實(shí)現(xiàn)的。但針對(duì)在癲癇模型中起關(guān)鍵作用的GABA能神經(jīng)元的間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的特異性分化以及用其治療癲癇以促進(jìn)療效的研究很少。盡管有研究顯示

5、BMSCs可以經(jīng)條件誘導(dǎo)培養(yǎng)向GABA能神經(jīng)元樣細(xì)胞分化,但需使用化學(xué)成分(如氯化鉀(potassium chloride,Kcl),β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol,BME),維甲酸(retinoic acid,RA)等)或細(xì)胞因子(如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)等,上述方案如果應(yīng)用于體內(nèi)則不僅難以實(shí)現(xiàn)而且可能產(chǎn)生無(wú)法預(yù)期的副作用。
　　堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)基因

6、在干細(xì)胞的增殖與分化過(guò)程中起著重要的作用,其中,促分化轉(zhuǎn)錄因子哺乳動(dòng)物無(wú)剛毛-鱗甲同源物(mammalian achaete-scute homologue,Mash1)基因作為bHLH家族中的一員,它不僅啟動(dòng)神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元的過(guò)程,而且同時(shí)決定著神經(jīng)元亞型的形成,與GABA能神經(jīng)元的分化形成有著密切的關(guān)系。本研究假設(shè),過(guò)表達(dá)BMSCs中的Mash1基因?qū)⒖纱龠M(jìn)其向 GABA能神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。本研究采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)使BMSCs

7、過(guò)表達(dá)Mash1基因,通過(guò)條件誘導(dǎo)培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)分化為GABA能神經(jīng)元樣細(xì)胞,對(duì)比BMSCs和Mash1過(guò)表達(dá)的BMSCs向GABA能神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的比率以驗(yàn)證假設(shè),并且將 Mash1過(guò)表達(dá)的BMSCs移植入癲癇大鼠模型體內(nèi),觀察其是否具有更進(jìn)一步抑制癲癇的治療效果。
　　第一部分大鼠來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取、體外分離、培養(yǎng)和鑒定
　　目的:建立成熟高效的提取、分離與鑒定BMSCs的方法。
　　方法:無(wú)菌手術(shù)取材2

8、～3周齡大鼠的雙側(cè)股骨與脛骨,提取骨髓,分別使用全骨髓貼壁培養(yǎng)法和應(yīng)用Histopaque?分離液的密度梯度離心分離法分離細(xì)胞并培養(yǎng),采用流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表面分子標(biāo)記并通過(guò)成脂肪、軟骨、骨誘導(dǎo)分化鑒定其多向分化潛能,使用噻唑藍(lán)(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)檢測(cè)增殖曲線。
　　結(jié)果:與全骨髓貼壁培養(yǎng)法相比,密度梯度分離法獲得的BM

9、SCs雜質(zhì)細(xì)胞少、細(xì)胞形態(tài)更標(biāo)準(zhǔn)并且均一,增殖曲線標(biāo)準(zhǔn)(接種第1～3天處于潛伏期,隨后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,至第7～9天時(shí)進(jìn)入平臺(tái)期),同時(shí)細(xì)胞表面分子標(biāo)記表達(dá)(密度梯度分離法提取并傳代得到的用于本實(shí)驗(yàn)研究的P3(passage3)代BMSCs低表達(dá)CD34抗原((1.79±0.23)%,圖4-A)并且高表達(dá)CD105抗原((98.6±0.68)%,圖4-B)、CD90抗原((98.5±1.02)%,圖4-C)和CD73抗原((98.8±0.

10、98)%,圖4-D)及多向分化潛能均符合國(guó)際統(tǒng)一規(guī)范。
　　結(jié)論:密度梯度離心分離法可以高效、便捷地獲得純度高、擴(kuò)增速度快、定向分化能力明確的符合國(guó)際統(tǒng)一規(guī)范的BMSCs,可以為下一步實(shí)驗(yàn)研究提供優(yōu)良的細(xì)胞材料。
　　第二部分過(guò)表達(dá)Mash1基因促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成GABA能神經(jīng)元分化
　　目的:研究Mash1基因過(guò)表達(dá)對(duì)BMSCs成GABA能細(xì)胞分化的作用。
　　方法:提取2～3周Sprague-Dawley

11、(SD)大鼠的BMSCs,傳至第3代;制備搭載Mash1基因的慢病毒載體,轉(zhuǎn)染BMSCs使其Mash1基因過(guò)表達(dá),采用復(fù)合誘導(dǎo)培養(yǎng)基(1×B27+1mM N6,O2二丁酰腺苷3’,5’-環(huán)磷酸(N6,O2’-dibutyryladenosine3’,5’-cyclicmonophosphate,Bt2cAMP)+1μMATRA+Neurobasal)體外誘導(dǎo)Mash1+-BMSCs和BMSCs成GABA能神經(jīng)元分化并做免疫細(xì)胞化學(xué)染色、

12、PCR檢測(cè)和Western blot檢測(cè)驗(yàn)證它們的分化趨勢(shì),同時(shí)行全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)了解分化細(xì)胞的電生理學(xué)特性。
　　結(jié)果:搭載Mash1基因的慢病毒轉(zhuǎn)染(感染指數(shù)MOI=100)BMSCs后Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示 Mash1表達(dá)獲得顯著提高;成 GABA能神經(jīng)元分化過(guò)程中Mash1+-BMSCs組(M-BMSCs)表現(xiàn)出更多的具有神經(jīng)元形態(tài)特征的細(xì)胞;誘導(dǎo)分化后Western blot和RT-PCR檢測(cè)顯示Mash1

13、+-BMSCs組的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元特異性核蛋白（neuron-specific nuclear protein,NeuN)和谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase,GAD)67的水平顯著高于對(duì)照組細(xì)胞;分化后細(xì)胞的細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)顯示M-BMSCs組(71.6±2.8)%中GAD67免疫熒光陽(yáng)性比率明顯高于BMSCs組(61.4±5.3)%、Lv-con-BMSCs組(58.6±5.4)%和M-con-BMS

14、Cs組(0),并且,M-BMSCs組(72.0±2.0)%中GABA免疫熒光陽(yáng)性比率明顯高于BMSCs組(61.4±2.9)%、Lv-con-BMSCs組(62.4±5.5)%和M-con-BMSCs組(0);全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)到成神經(jīng)元分化的細(xì)胞具有動(dòng)作電位和自發(fā)性抑制性突觸后電位提示其具有功能性。
　　結(jié)論:慢病毒介導(dǎo)的基因過(guò)表達(dá)具有良好的效果;Mash1基因過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)BMSCs向具有電生理活性的GABA能神經(jīng)元分化。

15、>　　第三部分 Mash1基因過(guò)表達(dá)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)大鼠癲癇模型的治療研究
　　目的:研究 Mash1基因過(guò)表達(dá)的BMSCs(M-BMSCs)對(duì)癲癇模型大鼠的治療作用。
　　方法:60只 SD大鼠行水迷宮訓(xùn)練形成空間記憶后使用匹魯卡品誘導(dǎo)制作癲癇模型并入組達(dá)到RacineⅤ級(jí)發(fā)作的大鼠;使用BrdU體外標(biāo)記M-BMSCs和BMSCs并通過(guò)立體定向聯(lián)合微量注射技術(shù)將 M-BMSCs(M-BMSCs組)、BMSCs(BMSC

16、s組)或大鼠成纖維細(xì)胞(陽(yáng)性對(duì)照組)注射入癲癇大鼠右側(cè)腦室完成細(xì)胞移植(細(xì)胞數(shù)量5×105個(gè)/只);其后選取不同時(shí)間點(diǎn)(移植后第7,14,21,28天)進(jìn)行功能學(xué)(水迷宮檢測(cè)、自發(fā)性癲癇發(fā)作頻率監(jiān)測(cè))、電生理(EEG)以及免疫組織化學(xué)(石蠟切片免疫熒光染色、尼氏染色、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)染色)檢測(cè)研究大鼠空間記憶能力、腦電圖變化和神經(jīng)元細(xì)胞層面在細(xì)胞移植之后產(chǎn)生的變化。
　　結(jié)果:細(xì)胞移植治療對(duì)

17、大鼠因癲癇導(dǎo)致的空間記憶能力損害具有保護(hù)作用,在移植第7天細(xì)胞移植的保護(hù)作用開始出現(xiàn),M-BMSCs組的保護(hù)作用的特點(diǎn)是出現(xiàn)早、效果明顯(逃避潛伏期時(shí)間恢復(fù)至接近正常大鼠水平),相比較而言,BMSCs組的效果與M-BMSCs組存在差異(P<0.05);細(xì)胞移植治療不僅可以降低大鼠造模后的死亡率(雖然各組數(shù)據(jù)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但M-BMSCs組和BMSCs組的死亡數(shù)量仍是低于陽(yáng)性對(duì)照組的),而且可以減低SRS的發(fā)生(雖然統(tǒng)計(jì)分析未見(jiàn)明顯差異

18、,但是在M-BMSCs組和BMSCs組仍可見(jiàn)SRS頻率的減少),并且在EEG電生理水平也表現(xiàn)出促進(jìn)恢復(fù)的作用:細(xì)胞移植治療后,與陽(yáng)性對(duì)照組相比,M-BMSCs組和BMSCs組的棘波和棘慢波的數(shù)量顯著減少(P<0.05),而且M-BMSCs組的效果優(yōu)于BMSCs組;免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)M-BMSCs組的大鼠腦內(nèi)海馬旁皮層NeuN+/BrdU+共表達(dá)細(xì)胞和GAD67+/BrdU+共表達(dá)細(xì)胞比率高于BMSCs組大鼠;尼氏染色計(jì)數(shù)海馬旁皮層空泡