從中醫(yī)“圓道”理論探討模擬微重力對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)及功能的影響.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bonemarrowmesenchymalstemcell,BMSCs)因其自身的優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為是不久即將被引入臨床治療的最優(yōu)干細(xì)胞,其研究從屬于前景開闊的再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,目前世界上有越來越多的學(xué)者投身到干細(xì)胞的研究中來,然而干細(xì)胞在臨床運(yùn)用的低效率與高風(fēng)險(xiǎn)是制約其廣泛運(yùn)用于臨床的瓶頸,如何能從干細(xì)胞本身著手提高干細(xì)胞的分化潛能使其高效安全的運(yùn)用于臨床是擺在研究者面前的難題。
　　近年來,隨著航空航天事業(yè)的迅猛發(fā)展,諸

2、多研究人員將研究手段發(fā)展到太空領(lǐng)域,并逐步認(rèn)識(shí)到微重力會(huì)對生物體的生理功能產(chǎn)生巨大的影響。微重力在細(xì)胞水平的作用也已引起了研究者的廣泛關(guān)注。研究表明諸多細(xì)胞在模擬微重力環(huán)境(simulatedmicrogravity,SMG)下可以呈現(xiàn)一種圓形改變,《內(nèi)經(jīng)》云“蓋有諸內(nèi)者,必形諸外”,細(xì)胞這種形態(tài)的改變必然會(huì)對其功能行為產(chǎn)生巨大的影響,在中醫(yī)圓道理論的指導(dǎo)下,我們推測模擬微重力為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞提供一種平衡、圓融的環(huán)境,這種環(huán)境更有利于

3、干細(xì)胞保持其自身的特性。為了證明此種推測,本實(shí)驗(yàn)研究模擬微重力干預(yù)對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)及增殖、分化、遷移等能力的影響,從而從干細(xì)胞本身著手,為臨床獲得高質(zhì)量、高誘導(dǎo)效率干細(xì)胞提供新的手段,本研究首次以“圓道”理論為指導(dǎo)提出模擬微重力處理這一促進(jìn)干細(xì)胞增殖、分化的新手段,為干細(xì)胞早日應(yīng)用于臨床提供新的思路。
　　實(shí)驗(yàn)一模擬微重力對BMSCs形態(tài)的影響
　　1.目的
　　研究SMG干預(yù)對BMSCs形態(tài)及細(xì)胞骨架的影響。<

4、br>　　2.方法
　　BMSCs體外原代分離培養(yǎng)后,流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行表面抗原鑒定,再將BMSCs隨機(jī)分為正常重力(NG)對照組與模擬微重力(SMG)48h、72h和120h組,光學(xué)顯微鏡下觀察各組BMSCs形態(tài)的改變,熒光染色觀察各組細(xì)胞骨架蛋白F-actin的變化。
　　3.結(jié)果
　　流式分析結(jié)果顯示原代培養(yǎng)的BMSCs表達(dá)CD44、CD90陽性(陽性率分別為94.74％和93.57%),表達(dá)CD34和CD45陰性。

5、光學(xué)顯微鏡下可見細(xì)胞在SMG干預(yù)后形態(tài)變圓,隨著SMG處理時(shí)間的延長,細(xì)胞的寬/長比值越接近1,這種形態(tài)的圓形改變在SMG刺激72h時(shí)最明顯,微重力處理時(shí)間延長至120h與SMG72h相比較,形態(tài)的改變沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。鬼筆環(huán)肽染色發(fā)現(xiàn)短時(shí)間的SMG干預(yù)可使細(xì)胞骨架張力下降,細(xì)胞骨架彌散,使細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)圓形改變,隨著微重力處理時(shí)間的延長,細(xì)胞骨架有重組跡象。
　　4.結(jié)論
　　BMSCs在SMG干預(yù)后可以呈現(xiàn)形態(tài)的“歸圓”改變

6、,這種形態(tài)的改變是通過SMG調(diào)整細(xì)胞骨架實(shí)現(xiàn)的。
　　實(shí)驗(yàn)二模擬微重力對BMSCs功能的影響
　　1.目的
　　研究SMG干預(yù)后形態(tài)改變的BMSCs增殖、凋亡、多潛能分化能力和遷移能力的變化。
　　2.方法
　　將三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞隨機(jī)分為NG組和SMG組(72h),研究:
　　2.1.增殖能力:①BrdU標(biāo)記法檢測兩組細(xì)胞BrdU陽性率。②兩組細(xì)胞在培養(yǎng)0、3、7天后,對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)繪制細(xì)胞生長曲

7、線,觀察細(xì)胞增殖情況。③流式細(xì)胞術(shù)檢測兩組細(xì)胞的凋亡率。
　　2.2.多潛能分化能力:①Q(mào)uantitativePCR及WesternBlotting檢測干細(xì)胞多潛能標(biāo)志OCT4的表達(dá)。②將兩組細(xì)胞在正常重力下分別進(jìn)行內(nèi)皮方向的誘導(dǎo)分化后,免疫熒光染色及WesternBlotting檢測兩組細(xì)胞VWF及CD31的表達(dá);脂肪方向的誘導(dǎo)分化后,光鏡下觀察油紅O染色陽性表達(dá)率,WesternBlotting檢測PPARγ2在各組細(xì)胞蛋白

8、水平的表達(dá)情況;神經(jīng)方向的誘導(dǎo)分化后,免疫熒光染色及WesternBlotting檢測兩組細(xì)胞MAP2及NF-H的表達(dá)情況。③隨后研究BMSCs在SMG環(huán)境中誘導(dǎo)分化能力的變化:將BMSCs在SMG條件下培養(yǎng)72h后,在SMG環(huán)境中分別進(jìn)行脂肪方向和神經(jīng)方向誘導(dǎo)后,重新檢測上述相關(guān)指標(biāo)的變化。
　　2.3.遷移能力:①細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測定兩組細(xì)胞劃痕后0h、24h、48h、72h劃痕的寬度。②WesternBlotting檢測兩組細(xì)胞

9、CXCR4的表達(dá)情況。
　　3.結(jié)果
　　3.1.增殖能力:①SMG組細(xì)胞BrdU陽性率較對照組增高(P<0.05)。②BMSCs生長曲線顯示,在培養(yǎng)第3天和第7天時(shí),SMG組細(xì)胞數(shù)量均較NG組增多。③流式細(xì)胞術(shù)顯示不同SMG組BMSCs與NG組BMSCs凋亡率無顯著差異。
　　3.2.多潛能分化能力:①Q(mào)uantitativePCR和WesternBlotting結(jié)果表明OCT4在SMG組細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),SMG72h

10、組升高最明顯。②在正常重力下內(nèi)皮方向的誘導(dǎo)結(jié)果表明:SMG組細(xì)胞VWF和CD31的表達(dá)量均較NG組增高。脂肪方向誘導(dǎo)結(jié)果表明:SMG組油紅O染色陽性表達(dá)率(47%)明顯高于NG組(18%),WesternBlotting結(jié)果顯示PPARγ2在SMG組的表達(dá)較NG組上調(diào)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。神經(jīng)方向誘導(dǎo)結(jié)果表明:SMG組細(xì)胞MAP2和NF-H的表達(dá)量上調(diào)較NG組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。③BMSCs在SMG環(huán)境中誘導(dǎo)分化能力的變化:兩組BMSCs在正常

11、重力條件下誘導(dǎo)后,OCT4僅有微量表達(dá),而細(xì)胞在SMG環(huán)境中脂肪方向誘導(dǎo)后,細(xì)胞油紅O染色陽性率極低(2%)且PPARγ2的表達(dá)量極少,但OCT4表達(dá)較前兩組升高(P<0.05)。SMG環(huán)境中神經(jīng)方向誘導(dǎo)后細(xì)胞MAP2及NF-H的表達(dá)量極少,但OCT4表達(dá)增多。
　　3.3.遷移能力:①細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示與NG組相比,SMG組在劃痕0h、24h、48h、72h后細(xì)胞劃痕距離差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。WesternBlotting結(jié)果分析,兩