去甲斑蝥素在大鼠體內(nèi)與阿霉素合用時的藥動學研究及相關毒理指標考察.pdf

1、一、目的 建立以高效液相色譜.質(zhì)譜聯(lián)用測定SD大鼠中去甲斑蝥素血漿藥物濃度的方法；研究去甲斑蝥素在SD大鼠體內(nèi)與阿霉素合用時的藥代動力學特性及肝組織分布，并考察去甲斑蝥素與阿霉素合用對肝、腎生化指標和組織學的影響，為去甲斑蝥素在治療肝癌時與阿霉素合用的合理性及安全性提供參考數(shù)據(jù)。 二、方法 1.實驗分組及給藥取健康SD大鼠16只，雌雄各半，隨機分成兩組，每組各8只。去甲斑蝥素與阿霉素聯(lián)合組即實驗組，以阿霉素注射劑

2、(ADM)按6mg·kg-1劑量于尾靜脈注射給藥，每天一次，連續(xù)給藥3天，在第4天按5mg·kg-1劑量于尾靜脈注射去甲斑蝥素(NCTD)；去甲斑蝥素組即對照組，每只大鼠按5mg·kg-1劑量于尾靜脈注射去甲斑蝥素(NCTD)。兩組分別于注射NCTD后0.083、0.167、0.5、1、3、6、12、24h眼眶取血制備血漿。 另取SD大鼠50只，雌雄各半，隨機分成NCTD組、ADM組和NCTD+ADM組，每組分為三個小組，每組各

3、5只，取5只為空白對照組，于每天上午定時給藥。NCTD組每只大鼠按去甲斑蝥素5mg·kg-1劑量于尾靜脈注射給藥，每天1次，連續(xù)注射7天。ADM組以阿霉素注射劑按6mg·kg-1劑量于尾靜脈注射給藥，每天1次，連續(xù)注射3天。NCTD+ADM組以阿霉素注射劑按6mg·kg-1劑量于尾靜脈注射給藥，每天1次，連續(xù)注射3天；去甲斑蝥素按5mg·kg-1劑量于尾靜脈注射給藥，每天1次，連續(xù)注射7天。動物以相同條件飼養(yǎng)，分別在第3天、第5天、第7

4、天于末次給藥后1h斷尾取血并處死大鼠，取肝、腎組織放置在-20℃冰箱中保存待測，測定NCTD組和NCTD+ADM組大鼠肝臟中NCTD的藥物濃度。取第3天處死組的大鼠在末次給藥后1h斷尾取血，以3000r.min-1離心，分離血清，做肝、腎生化指標檢查，取血后立即處死并解剖各大鼠，取其肝臟及腎臟組織做組織學檢查。 2.組織樣品預處理精密吸取樣品血漿或肝臟組織勻漿200μL，加入甲醇600μL，精密加入斑蝥素(49μg.ml-1)內(nèi)

5、標液20μL，混合均勻，渦旋震蕩3min，離心(10000 r.min-1)10min，精密吸取上清液20μL進樣。按色譜、質(zhì)譜條件進行分析。記錄測得的各樣品的色譜圖和去甲斑蝥素與內(nèi)標(斑蝥素)的峰面積(As和Ai)。 3.生物樣本測定方法HPLC-MS法測定SD大鼠血漿與肝臟組織中去甲斑蝥素的濃度。 4.血液生化指標檢查用全自動生化儀測定血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cre

6、a)的含量。 5.病理組織學檢查取肝臟、腎臟組織置于10％福爾馬林溶液中固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，蘇木精.伊紅(H.E)染色，在光學顯微鏡下觀察各組動物肝臟及腎臟組織的形態(tài)學改變。 三、結果 1.生物樣本測定血漿樣品中的NCTD濃度在0.53-21.2μg.ml-l范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)(R2=0.9995)，血漿樣品室溫放置及凍融穩(wěn)定性均穩(wěn)定，血漿的方法回收率在90％-110％范圍內(nèi)，樣品日內(nèi)、日間

7、變異系數(shù)均小于10％。 2.藥代動力學參數(shù)和肝組織分布NCTD組和NCTD+ADM組大鼠尾靜脈注射NCTD后，其在體內(nèi)快速分布，t1/2(α)分別為0.606h和0.584h，消除相對較快，t1/2(β)分別為5.13h和5.059h符合二室模型。NCTD+ADM組的分布速度常數(shù)(α)、分布相半衰期(t1/2(α))、中央室向周邊室的轉(zhuǎn)運速度常數(shù)(k12)與NCTD組比較有差異，去甲斑蝥素在與阿霉素合用后，對去甲斑蝥素在大鼠體內(nèi)

8、的消除相沒有明顯影響，只是改變了去甲斑螯素在體內(nèi)分布相的轉(zhuǎn)運速率，即去甲斑蝥素由中央室向周邊室的轉(zhuǎn)運速度加快，分布相半衰期減小。在多劑量連續(xù)給藥的第3、5、7天時，NCTD組和NCTD+ADM組在肝臟中的NCTD濃度分別為26.288±0.3133，29.483±0.8314；33.423±0.3257，36.770±0.2332:34.162±0.2505，37.540±0.3543 lag.mL-1。 NCTD+ADM聯(lián)合組

9、在肝臟中的NCTD藥物濃度明顯高于NCTD單用組。 3.血液生化指標檢查： 結果顯示去甲斑蝥素組血清中堿性磷酸酶(ALP)的活力較空白對照組有所升高，對其他相應生化指標均無明顯影響。阿霉素組血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和堿性磷酸酶(ALP)較對照組的酶活力都具有明顯增加，血清中尿素氮(BUN)和肌酐(Crea)含量也明顯增大(P<0.05)，提示阿霉素具有一定的肝、腎毒性。NCTD+ADM組血清中的生化指標與空白對照組相比

10、，差異有顯著性意義(P<0.05)：NCTD+ADM組與NCTD組及ADM組比較，生化指標也有差異(P<0.05)。 4.肝臟組織學改變NCTD組與空白對照組之間無顯著差異，肝臟及腎臟結構清晰，無明顯病理變化。ADM組和NCTD+ADM組肝臟及腎臟出現(xiàn)一定的細胞變性，有明顯的充血現(xiàn)象和炎性反應，炎細胞澿潤，肝細胞出現(xiàn)點狀及小灶樣壞死等程度的病理變化，說明ADM組和NCTD+ADM組都可引起肝臟和腎臟的損傷。 四、結論

11、 1.本試驗建立了以高效液相色譜.質(zhì)譜聯(lián)用法檢測SD大鼠血漿中去甲斑蝥素的方法，方法簡單，專屬性強，靈敏度高，準確性好，適于去甲斑螯素(NCTD)在大鼠體內(nèi)的定量分析和藥代動力學研究。 2.去甲斑蝥素在與阿霉素合用后，可改變?nèi)ゼ装唑胤植枷嗟霓D(zhuǎn)運速率，在多劑量連續(xù)給藥時可增加去甲斑蝥素在肝臟組織中的聚集，而提高肝臟組織中的藥物濃度。 3.實驗劑量的去甲斑蝥素與阿霉素的聯(lián)合化療比單用阿霉素對肝臟及腎臟的病理損傷相對較小