白楊素通過抑制自噬增強(qiáng)胰腺癌吉西他濱化療敏感性的實驗研究.pdf

1、第一部分白楊素抑制胰腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其線粒體途徑凋亡
　　目的：研究黃酮類化合物白楊素對人胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡等的影響及其可能的機(jī)制。方法細(xì)胞增殖活性采用 CCK-8法和克隆平板試驗檢測；細(xì)胞凋亡采用 Annexin V–FITC/PI雙標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)檢測；細(xì)胞周期采用PI單標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)檢測；免疫印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：白楊素能抑制胰腺癌細(xì)胞增殖和克隆形成，且這種作用呈時間和濃度依賴性；白楊素能阻滯細(xì)胞周期

2、于G0/G1期，并誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡；免疫印跡結(jié)果顯示，白楊素能引起PARP、Caspase-9、Caspase-3剪切體的激活，同時上調(diào)Bax/Bcl-2的比值。
　　結(jié)論：白楊素能抑制人胰腺癌細(xì)胞增殖和克隆形成能力，并阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期；白楊素能夠誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞發(fā)生線粒體途徑凋亡。
　　第二部分白楊素通過抑制溶酶體酶活性阻斷胰腺癌細(xì)胞自噬
　　目的：研究白楊素對人胰腺癌細(xì)胞自噬的影響及其可能的機(jī)制。

3、r>　　方法：構(gòu)建攜帶GFP標(biāo)簽的LC3過表達(dá)慢病毒載體并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞株，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi) GFP-LC3點狀聚集的數(shù)目；免疫印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況；免疫熒光法檢測自噬底物p62蛋白的表達(dá)；采用透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化；構(gòu)建攜帶GFP和mRPF雙標(biāo)簽的LC3過表達(dá)慢病毒載體并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞株，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)GFP-LC3和mRFP-LC3共定位關(guān)系；利用溶酶體探針LysoTracke

4、r Red檢測溶酶體與GFP-LC3之間的空間定位關(guān)系；采用AO（吖啶橙）染色觀察細(xì)胞內(nèi)酸性自噬泡的數(shù)目；采用組織蛋白酶活性測定試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)組織蛋白酶的活性情況。
　　結(jié)果：共聚焦結(jié)果顯示，白楊素能導(dǎo)致穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFP-LC3過表達(dá)慢病毒的胰腺癌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量GFP-LC3點狀聚集，且這種作用呈濃度和時間依賴性；同時，這種GFP-LC3綠色熒光與 LysoTracker Red紅色熒光具有共定位關(guān)系；免疫印跡和免疫熒光結(jié)果顯示，

5、白楊素可誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞自噬關(guān)鍵蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)增加，而自噬底物蛋白p62表達(dá)也增加；電鏡結(jié)果顯示，白楊素能誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)形成大量自噬泡；免疫印跡結(jié)果顯示，溶酶體抑制劑CQ與白楊素聯(lián)合作用后，LC3-Ⅱ的表達(dá)較單用CQ組無明顯增加；與CQ作用相似，白楊素能誘導(dǎo)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFP-mRPF-LC3過表達(dá)慢病毒的胰腺癌細(xì)胞內(nèi) GFP-LC3和 mRFP-LC3熒光共定位，而自噬激活劑 Rap作用后mRFP-LC3熒光顯著高于GFP-LC

6、3；AO染色結(jié)果顯示，白楊素與CQ均能顯著增加胰腺癌細(xì)胞內(nèi)酸性自噬泡的數(shù)量；組織蛋白酶活性檢測和免疫印跡結(jié)果顯示，白楊素能抑制胰腺癌細(xì)胞內(nèi)組織蛋白酶B和組織蛋白酶D的活性。
　　結(jié)論：白楊素通過抑制溶酶體酶活性阻斷胰腺癌細(xì)胞自噬。
　　第三部分白楊素通過抑制自噬增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞對吉西他濱化療敏感性
　　目的：探討白楊素聯(lián)合吉西他濱對胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其機(jī)制。
　　方法：細(xì)胞增殖活性采用CCK-8法檢測；細(xì)

7、胞凋亡采用Annexin V–FITC/PI雙標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)檢測；倒置顯微鏡觀察藥物單用或聯(lián)用對細(xì)胞形態(tài)的影響；免疫印跡法檢測自噬和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)；采用RNAi技術(shù)沉默自噬關(guān)鍵基因Beclin1、ATG5、ATG7后檢測吉西他濱對胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡作用的變化。
　　結(jié)果：吉西他濱能通過濃度和時間依賴性方式部分抑制胰腺癌細(xì)胞增殖；免疫印跡結(jié)果顯示，吉西他濱可誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞 LC3-Ⅱ的表達(dá)增加，而自噬底物蛋白 p62則表達(dá)減少；

8、吉西他濱與溶酶體抑制劑CQ合用后，LC3-Ⅱ的表達(dá)較單用CQ顯著增加；無論是聯(lián)合自噬抑制劑 CQ或是沉默自噬關(guān)鍵基因 Beclin1、ATG5、ATG7后，均能顯著增加吉西他濱對胰腺癌細(xì)胞的殺傷效果；當(dāng)吉西他濱與白楊素聯(lián)合使用后， LC3-Ⅱ的表達(dá)較二者單用顯著增加；同時，兩藥聯(lián)用較單藥使用更能抑制胰腺癌細(xì)胞活性并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而在聯(lián)用基礎(chǔ)上加入CQ后并未增加細(xì)胞殺傷效果；免疫印跡結(jié)果顯示，兩藥聯(lián)用較單藥使用更能增加PARP、Caspa