脫氧核酶的可視化篩選及其抑制鼻咽癌EBV-LMP1基因表達的實驗研究.pdf

1、鼻咽癌是我國高發(fā)腫瘤，國內(nèi)外一系列研究證明EB病毒編碼的LMPl對其發(fā)生發(fā)展中起重要作用，被認為是鼻咽癌的癌基因。目前，脫氧核酶是基因治療的一種嶄新的分子生物學工具，能夠?qū)NA分子在未配對的嘌呤和配對的嘧啶之間切斷，從而調(diào)控基因的表達。本研究針對LMPlmRNA設計合成10-23型脫氧核酶(10-23DRz)，觀察其在細胞內(nèi)外篩選的差異性及其抑制鼻咽癌EBV-LMPl基因表達的效應。希望建立一個脫氧核酶簡便可行的的熒光可視化篩選方法，

2、并為鼻咽癌的預防和臨床治療開創(chuàng)一個新的方法。 目的： 1、調(diào)查研究我國西部重慶地區(qū)鼻咽癌患者及非鼻咽癌對照者外周血血漿中EB病毒LMPl基因攜帶情況及LMPl基因C端30個堿基缺失和N端XhoI酶切位點缺失變異情況。為進一步探討具有缺失型LMPl的EBV與鼻咽癌的相關性提供實驗依據(jù)。 2、選擇EBV-LMPl基因為脫氧核酶治療鼻咽癌的靶基因，針對EBV-LMPlmRNA設計合成多種10-23DRz，并對其轉染效率

3、及其在細胞內(nèi)的分布情況進行評價。 3、通過體外轉錄技術，經(jīng)細胞外分子水平切割篩選具有高效性和特異性的脫氧核酶，并觀察RNA堿基長度對脫氧核酶體外剪切效率的影響。為探索脫氧核酶細胞外分子水平切割篩選的優(yōu)化體系提供參考。 4、構建EBV-LMPl綠色熒光融合真核表達載體，在鼻咽癌細胞中實現(xiàn)EBV-LMPl增強型綠色熒光融合蛋白表達。 5、在已建立的熒光可視化細胞平臺上，從細胞水平再次篩選高效性和特異性的脫氧核酶；并觀

4、察脫氧核酶抑制細胞內(nèi)EBV-LMPl基因表達情況及對癌細胞的生物學效應。希望建立一個脫氧核酶簡便可行的的熒光可視化篩選方法，并為研究脫氧核酶在體內(nèi)水平的治療應用打下基礎。 方法： 1、對48例鼻咽癌患者和40例非鼻咽癌對照者的外周血血漿進行DNA抽提，分別對LMPlC端和N端進行PCR擴增。PCR擴增產(chǎn)物通過PAGE膠電泳、限制性酶切、序列測定等來分析LMPlC端有無30個堿基的缺失及N端有無XhoI酶切位點的缺失變異。

5、 2、以B95—8來源的LMPlmRNA為基礎，應用RNA結構預測軟件模擬預測LMPlmRNA的二級結構，選擇具有高度特異性和高度保守性的環(huán)狀膨出核苷酸序列為脫氧核酶結合靶序列，選擇AU為切割靶點，設計10-23DRz及其對應的的突變體和反義寡聚核苷酸；將脫氧核酶5’端用FITC標記來檢測脫氧核酶的轉染效率及其在細胞內(nèi)的分布情況；將脫氧核酶側臂及寡聚核苷酸兩端各2個堿基進行硫代修飾來增加它們的穩(wěn)定性。 3、從B95—8細

6、胞中提取總RNA及基因組DNA，分別通過RT-PCR及PCR擴增LMPlcDNA及DNA片段，構建重組T載體pMDl8-T-LMPlm和pMDl8-T-LMPId；再以重組T載體為模板，PCR擴增LMPl相關片段，構建重組體外轉錄載體pGEM一1lzf-LMPlm、pGEM一11zf-LMPla、pGEM一1lzf-LMPlc；將重組體外轉錄載體線形化后，用體外轉錄技術轉錄出LMPlmRNA；模擬體內(nèi)生理條件，用設計的侯選脫氧核酶在細胞

7、外分子水平對轉錄出的3種RNA模板進行剪切篩選，分析剪切效率，篩選出高效率的脫氧核酶；同時與突變體和反義寡聚核苷酸進行切割對比、與長短不同的RNA模板進行切割對比來分析脫氧核酶的特異性。 4、以重組T載體為模板，PCR擴增LMPl相關片段，構建LMPl增強型綠色熒光融合蛋白真核表達載體pEGFP-N1一LMPlm、pEGFP—C1一LMPlm、pEGFP-N1一LMPla、pEGFP-Cl—LMPlc，用脂質(zhì)體轉染法將它們轉入鼻

8、咽癌低分化CNE2細胞，在活細胞狀態(tài)下用熒光倒置顯微鏡觀察融合蛋白熒光表達及亞細胞分布情況；用RT-PCR及westernblot檢測來驗~j[LMPl熒光融合真核表達是否成功。5、將FITC標記的脫氧核酶，通過脂質(zhì)體轉染轉入鼻咽癌細胞CNE2中，應用熒光顯微鏡檢測脫氧核酶在細胞中的分布定位，應用流式細胞術檢測脫氧核酶在細胞中的轉染效率，用MTT法檢測脫氧核酶的細胞毒性作用；利用已建立的熒光可視化細胞平臺，將脫氧核酶與重組熒光融合真核表

9、達載體共轉染入鼻咽癌CNE2細胞，在活細胞狀態(tài)下用熒光顯微鏡直接觀察熒光融合蛋白在細胞中的表達量差異，用Image-ProPlus軟件進行熒光強度分析，計算熒光表達抑制率，用SPSS11．O軟件統(tǒng)計分析，在細胞水平來篩選高效性和特異性的脫氧核酶，并與細胞外分子水平篩選結果相比較；將篩選出的高效特異的脫氧核酶與載體pEGFP-C1一LMPlm共轉染入鼻咽癌CNE2細胞，通過熒光顯微鏡和流式細胞技術檢測脫氧核酶對LMPl熒光融合蛋白表達量的

10、影響，用MTT法檢測對鼻咽癌細胞的增殖生長影響，用AO／EB法檢測對鼻咽癌細胞凋亡的影響，用RT-PCR檢測脫氧核酶對LMPl基因在mRNA水平的抑制作用，用westernblot檢測脫氧核酶對LMPl基因在蛋白質(zhì)水平的抑制作用。 結果： 1、48例NPC患者EBV-LMPl檢出率為100％，40例非鼻咽癌對照者EBV-LMPl檢出率為95％。鼻咽癌患者及非鼻咽癌對照者中均未發(fā)現(xiàn)C端30bp的缺失和N端XhoI酶切位點缺

11、失變異。 2、針對LMPlmRNA共設計出7種脫氧核酶，其中針對exonamRNA有DZl67、DZl93、DZ211共3種，針對exoncmRNA有DZ509、DZ827、DZ893、DZl037共4種；同時設計了DZ509的突變體mut-DZ509及其反義寡聚核苷酸ASODN509和熒光標記的FITC-DZ509；所有脫氧核酶兩端各2個堿基進行了硫代修飾。 3、(1)成功構建重組T載體pMDl8-T-LMPlm和pM

12、Dl8-T-LMPld及重組體外轉錄載體pGEM—11zf-LMPlm、pGEM一11zf-LMPla、pGEM-11zf-LMPlc；(2)細胞外分子水平剪切篩選結果：對模板LMPlexonamRNA剪切率DZl67>DZl93>DZ211；對模板LMPlexoncmRNA剪切率DZ509>DZ893~DZl037>DZ827，同時DZ509>mut-DZ509>ASODN509；DZ509對exonamRNA無剪切活性，DZl67對

13、exoncmRNA無剪切活性；DZ509和DZl67對全長LMPlmRNA都有剪切活性，但剪切率較單純外顯子mRNA剪切率更低。 4、成功構建LMPl綠色熒光融合蛋白真核表達重組載體pEGFP-N1一LMPlm、pEGFP-C1一LMPlm、pEGFP-N1一LMPla、pEGFP-C1．LMPlc；重組載體轉入CNE2細胞后可見熒光融合蛋白主要分布于細胞漿和細胞膜，部分呈顆粒狀；用RT-PCR檢測和westernblot檢測表

14、明LMPl融合蛋白表達成功。 結論： l、我國西部重慶地區(qū)鼻咽癌和非鼻咽癌對照者血漿中攜帶的EB病毒LMPl基因C端不存在30bp缺失，N端不存在XhoI酶切位點缺失變異，與我國鼻咽癌高發(fā)區(qū)廣東地區(qū)和我國低發(fā)區(qū)東北地區(qū)健康攜帶者外周血攜帶的EB病毒LMPl基因相似。因此，我們認為缺失型EB病毒并沒有選擇性地感染鼻咽癌病人，EB病毒LMPl基因N端和C端的缺失突變，可能是在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過程中產(chǎn)生的，并不是先有缺失突變，

15、再選擇性地感染鼻咽癌病人。至于LMPlC端30bp缺失和N端XhoI酶切位點缺失變異與鼻咽癌的相關性還需進一步研究。 2、細胞外分子水平篩選結果表明DZl67和DZ509切割LMPlmRNA具有高效性和序列特異性。脫氧核酶對長度不同的mRNA的剪切效率有差異。為更好的反應實際剪切效率，我們認為最好用全長mRNA進行二級結構預測、靶點選擇及細胞外分子水平剪切篩選。這為探索脫氧核酶細胞外分子水平切割篩選的優(yōu)化體系提供了實驗依據(jù)。重組

16、體外轉錄載體還可進一步轉錄出標記RNA，這為LMPl的Northernblot或Southernblot等檢測研究奠定了基礎。 3、利用熒光融合表達技術，我們實現(xiàn)了LMPl蛋白的N端部分、C端部分、及全長蛋白在鼻咽癌CNE2細胞中熒光融合表達，建立了LMPl熒光可視化鼻咽癌細胞平臺。為針對LMPl的脫氧核酶在細胞水平的篩選實現(xiàn)熒光可視化成為可能，并為觀察脫氧核酶抑制鼻咽癌細胞內(nèi)EBV-LMPl基因表達情況及對癌細胞的生物學效應奠

17、定了細胞基礎，并有希望用G418篩壓整合，建立EBV-LMPl增強型綠色熒光融合蛋白長期穩(wěn)定表達的鼻咽癌細胞株。同時為進一步研究LMPl蛋白質(zhì)的亞結構功能提供了研究平臺。 4、脫氧核酶可經(jīng)脂質(zhì)體轉染進入鼻咽癌細胞，有一定的劑量依賴關系，分布于細胞漿和細胞核，對靶細胞沒有明顯的細胞毒性，具有潛在的開發(fā)和應用價值。 5、細胞內(nèi)水平熒光可視化篩選結果表明DZl67和DZ509抑制LMPl基因熒光融合表達具有高效性和特異性，與細