胚胎后腎間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)染uPA基因移植治療單側(cè)輸尿管梗阻大鼠的實驗研究.pdf

1、研究背景：慢性腎臟疾病(CKD)日益成為全球性的公共健康問題，盡管腎臟替代療法(RRT)在CKD的治療方面取得了很大的進展，但接受透析患者的死亡率仍高達21％～23％，腎臟移植則因為供腎來源不足，配型困難，治療費用高，移植后排異反應(yīng)未能徹底控制等原因不能廣泛應(yīng)用于臨床。CKD的發(fā)病機制是進行性間質(zhì)纖維化，細胞外基質(zhì)(ECM)過渡積聚是纖維化的主要病理改變，因此逆轉(zhuǎn)間質(zhì)纖維化是治療所有CKD的共同途徑?；蛑委熎鞴俳M織纖維化已成為慢性疾病

2、治療領(lǐng)域中的研究熱點，應(yīng)用uPA基因治療肝臟纖維化和肝硬化以及肺纖維化在國內(nèi)外均有許多嘗試，但單一應(yīng)用uPA治療器官纖維化，效果并不十分顯著。腎纖維化不只是單純的ECM沉積，重要的是ECM破壞了臨近的細胞結(jié)構(gòu)，導致腎單位的減少。即使uPA降解了ECM，如果沒有足夠的再生細胞重建有功能的腎單位，也不一定能改善腎功能。故只有在細胞死亡之前逆轉(zhuǎn)纖維化，或同時重建完整的、有功能的腎單位，才能在臨床上取得一定的療效。 由于干細胞具有自我更

3、新和分化能力，近幾年，應(yīng)用干細胞移植治療腎臟疾病已成為該領(lǐng)域的另一研究熱點。胚胎后腎間充質(zhì)(MM)含有胚胎腎干細胞，其具有定向發(fā)育的潛能，在適當?shù)恼T導條件下，后腎間充質(zhì)細胞可以分化為腎單位。該類細胞可生長成腎臟樣器官，具有正常腎臟的結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)，在光鏡或電鏡下，由MM形成的成熟腎單位和集合管與正常腎臟無區(qū)別。目前尚未見后腎間充質(zhì)細胞對慢性腎臟疾病是否有修復作用的報道。對于CKD，由于腎間質(zhì)纖維化占據(jù)了細胞再生的空間，干細胞即使能歸巢到

4、病變部位，其分化、再生能力可能會受到限制。因此我們設(shè)想將胚胎后腎間充質(zhì)細胞作為基因載體細胞增強局部uPA的表達，從而降解ECM，為更多的胚胎后腎間充質(zhì)細胞歸巢提供空間，從而促進腎功能的恢復。為此，我們：①將胚胎后腎間充質(zhì)細胞移植治療單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠模型，觀察其是否對腎臟有保護作用；②將uPA基因?qū)肱咛ズ竽I間充質(zhì)細胞，利用干細胞歸巢的特性，將基因靶向損傷部位，以期分泌uPA，降解ECM，同時修復損傷的腎臟細胞或再生為腎臟細胞

5、：③觀察腎功能、腎臟纖維化相關(guān)因子的變化，追蹤胚胎后腎間充質(zhì)細胞歸巢情況，并對其保護機制做一探索性研究。將細胞治療和基因治療相結(jié)合，旨在探求阻止慢性腎臟疾病進展的新方法. 目的：研究胚胎后腎間充質(zhì)細胞和轉(zhuǎn)染uPA基因的胚胎后腎間充質(zhì)細胞移植對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠損傷腎臟的再生修復作用及其可能機制。 方法： 1.構(gòu)建并包裝尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-type pla一sminogen activato

6、r，uPA)基因重組GFP-腺相關(guān)病毒重組質(zhì)粒(pAAV-hrGFP-uPA)。(1)用RT-PCR方法從幼鼠腎臟總RNA中擴增出uPA cDNA片段，在T4DNA連接酶的作用下，構(gòu)建uPA基因重組GFP-腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒(pAAV-hrGFP-uPA)。(2)重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I和XhoI酶切鑒定和DNA序列分析。(3)采用磷酸鈣共沉淀法，以重組質(zhì)粒pAAV-hrGFP-uPA和輔助質(zhì)粒pAAV-RC、pHelper以

7、及pAAV-IRES-hrGFP、pAAV-RC和pHelper共轉(zhuǎn)染AAV-293細胞，產(chǎn)生具有感染性的病毒顆粒：rAAV病毒顆粒和AAV病毒顆粒。(4)用點雜交法測定重組病毒顆粒的滴度。(5)病毒顆粒再轉(zhuǎn)染AAV-293細胞以測定其感染能力。 2.體外將大鼠胚胎后腎間充質(zhì)細胞株(RIMM-18細胞)轉(zhuǎn)染rAAV和AAV病毒顆粒，并通過綠色熒光蛋白(GFP)觀察細胞的病毒轉(zhuǎn)染率。(1)體外培養(yǎng)的RIMM-18細胞轉(zhuǎn)染rAAV和

8、AAV病毒顆粒，MOI=1×105。(2)在倒置熒光顯微鏡下觀察48h的RIMM-18細胞的GFP表達，據(jù)此計算病毒轉(zhuǎn)染率。(3)轉(zhuǎn)染后的RIMM細胞進行傳代。(4)轉(zhuǎn)染后的RIMM-18細胞通過細胞HE染色、Giemsa染色和波形蛋白、角蛋白免疫組化染色對RIMM-18細胞進行生物學鑒定。(5)RT-PCR和Westernblotting技術(shù)對轉(zhuǎn)染后的RIMM-18細胞進行檢測。 3.研究RIMI-18細胞和轉(zhuǎn)染uPA基因的R

9、IMM-18細胞通過尾靜脈注射對UUO大鼠模型的再生修復作用，并探討其作用機制。(1)雌性3月齡SD大鼠200只建立UUO模型，隨機分為模型組(40只)，培基組(40只)，rAAV細胞組(40只)，AAV細胞組(40只)，細胞組(40只)。UUO模型建立的同時除模型組不做其他處理外，其它四組分別通過尾靜脈注射無血清培養(yǎng)基，rAAV轉(zhuǎn)染的RIMM-18細胞、AAV轉(zhuǎn)染的RIMM-18細胞、未轉(zhuǎn)染的RIMM-18細胞。(2)術(shù)后7d、14d

10、、21d、28d收集尿液和血液用于檢測24h尿蛋白、血肌酐、尿素氮、白蛋白和內(nèi)生肌酐清除率，收集腎組織用于免疫組化、Western blotting、實時定量PCR等方法檢測。uPA、PAI-1、TGF-β1蛋白和基因。(3)術(shù)后1.5d、3d、7d、14d、21d、28d收集rAAV細胞組和AAV細胞組大鼠梗阻側(cè)腎臟、對側(cè)腎臟、肝臟、脾臟、心肌和外周血涂片，在倒置熒光顯微鏡下觀察各組織GFP的表達。 結(jié)果： 1.(1)

11、通過RT-PCR方法從大鼠腎臟總RNA中擴增出的uPA cDNA與所需的大小一致。(2)成功地構(gòu)建uPA基因重組GFP-腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒。(3)質(zhì)粒經(jīng)AAV-293細胞包裝后成為具有傳染性的病毒顆粒，點雜交法測定rAAV病毒顆粒的滴度為1.12×1012vg/mL，AAV病毒顆粒的滴度為1.0×1012vg/mL。(4)當MOI=1×105vg/札時，rAAV病毒顆粒再轉(zhuǎn)染AAV-293細胞后48h的熒光率為80％，AAV病毒顆粒再轉(zhuǎn)

12、染AAV-293細胞后48h的熒光率為95％。 2.(1)rAAV和從v病毒顆粒對RIMM-18細胞進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染率為60％。(2)轉(zhuǎn)染后的RIMM細胞進行傳代，隨著傳代次數(shù)的增加GFP表達減弱。(3)轉(zhuǎn)染的RIMM-18陽性細胞仍保持其原有特性：波形蛋白陽性，角蛋白陰性。(4)RT-PCR技術(shù)檢測到rAAV轉(zhuǎn)染的RIMM-18有uPA基因，而AAV轉(zhuǎn)染的RIMM-18沒有uPA基因。(5)Westernblotting技術(shù)沒有

13、檢測到轉(zhuǎn)染后的RIMM-18細胞有uPA表達。 3.(1)14d、21d、28d rAAV細胞組、AAV細胞組和細胞組較模型組和培基組腎間質(zhì)損害明顯降低。(2)各組各時間點24h尿蛋白定量、白蛋白、血尿素氮、內(nèi)生肌酐清除率無顯著差異。且14d、28d時，rAAV細胞組、AAV細胞組和細胞組血肌酐明顯少于模型組和培基組。(3)免疫組化染色顯示rAAV細胞組、AAV細胞組和細胞組uPA半定量評分較模型組和培基組增高，PAI-1、TG

14、F-β1半定量評分較模型組和培基組降低。(4)實時定量PCR檢測rAAV細胞組uPA基因較模型組、培基組、AAV細胞組和細胞組增多，且各時間點rAAV細胞組uPA基因無顯著性差異。實時定量PCR檢測rAAV細胞組、AAV細胞組和細胞組較模型組和培基組PAI-1、TGF-β1基因少。(5)Western blotting檢測rAAV細胞組、AAV細胞組和細胞組較模型組和培基組uPA蛋白明顯增高，PAI-1和TGF-β1蛋白明顯降低。(6)

15、rAAV細胞組和AAV細胞組大鼠1.5d、3d、7d、14d、21d、28d時均可見梗阻側(cè)腎組織有GFP表達；對側(cè)腎組織也有GFP表達。1.5d、3d時可見肝臟、脾臟有GFP表達，7d、14d、21d、28d時肝臟、脾臟GFP表達明顯減弱。各時間點心肌組織、外周血涂片未見GFP表達。 結(jié)論： 1.包含uPA基因的GFP-腺相關(guān)病毒重組質(zhì)粒已成功構(gòu)建并包裝成具有感染性的病毒顆粒。 2.rAAV和AAV病毒顆粒對RI

16、MM-18細胞的轉(zhuǎn)染率高，達60％，腺相關(guān)病毒載體可介導uPA因轉(zhuǎn)染。 3.(1)RIMM-18細胞通過尾靜脈移植能改善UUO大鼠腎功能，減輕纖維化。(2)轉(zhuǎn)基因的uPA因無表達，AAV載體本身對細胞無影響。(3)通過GFP的表達可以觀察到轉(zhuǎn)染rAAV和AAV病毒顆粒的RIMM-18細胞進入損傷腎臟，主要分布在腎小管，參與損傷腎臟的修復。(4)對側(cè)腎臟和肝臟、脾臟均有GFP陽性細胞，心肌和外周血涂片未發(fā)現(xiàn)GFP陽性細胞。(5)實