Adiponectin基因修飾的脂肪干細胞對野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠的影響及機制.pdf

1、背景：肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一大類以肺動脈壓力增高為特征的惡性肺血管疾病。肺血管重構是其重要的病理特征，主要表現為肺動脈內皮受損、平滑肌層和外膜增厚、纖維化，血管周圍炎癥細胞浸潤，最終造成管腔狹窄、閉塞。延緩肺血管重構，改善PAH患者心肺功能成為治療PAH，提高患者生存率的關鍵靶點。脂肪干細胞（adipose tissue-derived stem cells，ADSCs）

2、具有分化成多種細胞組織的潛能，可分泌多種細胞因子，增加內皮細胞一氧化氮（nitric oxide，NO）的分泌，促進血管再生。我們課題組前期的研究發(fā)現，ADSCs能夠定植于野百合堿（monocrotaline，MCT）誘導的PAH大鼠的肺動脈并分化為肺動脈內皮，降低肺動脈壓力、改善肺動脈和右心室重構。脂聯素（adiponectin，APN）具有胰島素增敏、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗炎和抗增殖等多種生物學特性，能通過多重機制保護血管。我們

3、曾經成功克隆過人APN全長基因，在此基礎上，我們將攜帶APN基因的慢病毒導入ADSCs，觀察APN基因修飾的ADSCs移植治療是否優(yōu)于單純的ADSCs移植治療，從而為肺動脈高壓患者未來的干細胞和基因治療提供理論依據。
　　目的：①探討單純ADSCs移植和APN基因修飾的ADSCs移植對PAH大鼠心肺結構及功能的影響。②探討單純ADSCs移植和APN基因修飾的ADSCs移植對PAH大鼠代謝模式的影響。③觀察APN對 PAH大鼠肺小動

4、脈平滑肌細胞增殖情況的影響并探討其與BMP2/smad信號通路的聯系。
　　方法：⑴實驗設計：本研究采用MCT誘導大鼠肺動脈高壓動物模型，觀察經ANP基因修飾的ADSCs移植對PAH大鼠心血管結構、功能及代謝組學的影響。80只SD大鼠，隨機分為正常對照組（NC組）、肺動脈高壓組（PAH組）、脂肪干細胞治療組（ADSCs組）、導入空載慢病毒的脂肪干細胞治療組（ADSCs-V組）和APN基因修飾的脂肪干細胞治療組（ADSCs-APN組

5、）。PAH組、ADSCs組、ADSCs-V組和ADSCs-APN組給予一次性腹腔注射MCT40mg/kg，NC組予等量生理鹽水注射。MCT注射后14天，ADSCs組、ADSCs-V組和ADSCs-APN組分別經頸外靜脈注13106cells/ml的ADSCs、感染空載慢病毒的ADSCs和APN基因修飾的ADSCs，PAH組和NC組予等量生理鹽水注射。（其中40只大鼠測壓，另外40只大鼠采血送代謝檢測及其他各項檢查）。⑵ADSCs培養(yǎng)：取

6、大鼠腹股溝脂肪組織，用酶消化法進行脂肪干細胞的分離和培養(yǎng)，流式細胞儀鑒定細胞免疫表型，成脂、成骨誘導培養(yǎng)鑒定細胞多項分化功能。將過表達APN的慢病毒導入ADSCs，用ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液APN的表達。將導入APN的ADSCs移植入PAH大鼠體內，激光共聚焦檢測其在肺組織的定位。⑶形態(tài)和功能研究：細胞移植3周后，右心導管法檢測各組大鼠平均肺動脈壓（mean pulmonary arterial pressure，mPAP）、稱重法

7、計算右心室肥厚指數（right ventricular hypertrophy index，RVHI），肺小動脈離體血管環(huán)張力試驗評估血管收縮與舒張功能，HE染色觀察肺血管病理變化并計算肺小動脈的管壁厚度指數（WT％）及相對管壁面積指數(WA%)，ELISA檢測血清APN含量，免疫組織化學染色檢測肺動脈內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）的表達、超聲心動圖檢測右心結構及功能。

8、⑷代謝組學研究：采用核磁共振技術（NMR）技術，進行血清NMR氫譜檢測分析各組代謝物濃度。采用Chenomx NMR Suite8.0軟件對NMR數據進行PCA、PLS-DA統(tǒng)計分析，利用排列檢測（Permutation test）檢驗方法評價PLS-DA模型的質量，p<0.001表示模型建立水平很好。⑸分子機制研究：酶消化法分離培養(yǎng)PAH大鼠肺動脈平滑肌細胞（pulmonary arterial smoothmuscle cell，P

9、ASMCs），免疫細胞染色檢測其α-actin表達。分別用BMP抑制劑、腺苷酸活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase,AMPK)抑制劑干預PASMCs，Western blot檢測骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein2，BMP2）、p-Smad1/5/8、Smad1/5/8/9、p-AMPK和AMPK蛋白的表達，CCK-8檢測細胞增殖情況。⑹統(tǒng)計方法：用SPSS19.0

10、統(tǒng)計軟件包對數據進行分析。所有計量數據以均數±標準差（X±S）表示。組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進行分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。Pearson相關分析心臟彩超測量值與mPAP、RVHI、WA%和WT%之間的關系。P<0.05定義為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：①ADSCs流式細胞儀鑒定CD29和CD90陽性、CD34、CD45和 CD31陰性，成脂誘導7天后油紅染色見細胞漿內脂滴染成紅色，成

11、骨誘導茜素紅染色顯示胞漿內的鈣化顆粒被染成棕紅色。導入APN基因的ADSCs能夠穩(wěn)定表達APN蛋白，并在肺組織定位。移植APN高表達的ADSCs能降低PAH大鼠mPAP(NC組:16.38±0.91mmHg；PAH組：32.62±1.77 mmHg；ADSCs組：27.11±2.12 mmHg；ADSCs-V組：26.44±2.91mmHg；APDSCs-APN組：21.44±0.89mmHg；P<0.05)、RVHI(NC組:25.7

12、9±1.81%；PAH組：56.27±2.18%；ADSCs組：47.94±2.87%；ADSCs-V組：47.57±3.39%；APDSCs-APN組：45.23±1.95%；P<0.05)、WT%和 WA%；肺小動脈內皮依賴性的舒張功能和非內皮依賴性的舒張功能得到同步改善，肺小動脈內膜eNOS的表達明顯增強。超聲心動圖顯示右室結構及功能均有不同程度的恢復。APN基因修飾的ADSCs移植治療效果優(yōu)于單純的ADSCs移植治療。心臟彩超各

13、測量值與mPAP、RVHI、WA%和WT%之間的存在不同程度的相關性。②PAH大鼠血清代謝物中血清葡萄糖、乳酸濃度明顯升高，血清丙氨酸濃度明顯降低。APN基因修飾的ADSCs移植治療能降低PAH大鼠血清葡萄糖、乳酸濃度，升高血清丙氨酸濃度。單純ADSCs移植治療不能明顯改變PAH大鼠代謝模式。③APN呈濃度依賴性地增加肺動脈平滑肌細胞BMP2的表達，BMP的抑制劑可減少APN誘導的BMP2、p-Smad1/5/8蛋白的表達，促進細胞增殖

14、；AMPK抑制劑可減少APN誘導的p-AMPK和BMP2蛋白的表達。
　　結論：⑴導入APN基因的ADSCs移植后可定位于肺組織，并分泌APN。ADSCs和APN基因修飾的ADSCs治均可在不同程度上增加肺血管內皮eNOS的表達，減少肺動脈重構，改善血管舒張功能，降低肺脈高壓，改善右心室功能。APN聯合ADSCs移植治療優(yōu)于單純ADSCs移植治療。右心結構\功能與肺動脈重構密切相關。⑵APN基因修飾ADSCs移植治療可以改善MCT