誘導(dǎo)型環(huán)氧合酶及CD40配體對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的 Rose認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是一種炎癥性疾病，炎癥反應(yīng)貫穿于AS病變的發(fā)生、發(fā)展及斑塊穩(wěn)定性的各個(gè)階段并扮演了十分重要的角色。誘導(dǎo)型環(huán)氧合酶(COX-2)及CD40與其配體(CD40L)均在炎癥性疾病中起著重要作用。二者相互作用不只局限于炎癥細(xì)胞之間信號(hào)傳遞，還參與AS內(nèi)主要細(xì)胞成分(包括血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)，并通過(guò)調(diào)節(jié)一系列細(xì)胞因子和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路影響AS的發(fā)生、發(fā)展及斑塊的穩(wěn)定性

2、，有可能成為防治AS或急性冠脈綜合征(ACS)潛在的新靶點(diǎn)。膠原含量和基質(zhì)金屬蛋白酶水平是評(píng)價(jià)斑塊易損性的重要指標(biāo)。雖然初步研究發(fā)現(xiàn)CD40-CD40L可以誘導(dǎo)AS細(xì)胞中COX-2的表達(dá)，但CD40-CD40L引發(fā)的一系列致AS反應(yīng)是否與誘導(dǎo)COX-2表達(dá)有關(guān)尚不明確，而且二者之間的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制還不很清楚，該課題就此進(jìn)行了研究。首先，以AS斑塊中膠原含量和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)水平作為評(píng)價(jià)斑塊易損性的指標(biāo)，探討COX-2與AS斑塊穩(wěn)

3、定性之間的關(guān)系及COX-2抑制劑對(duì)其的作用。其次，離體水平觀察COX-2和rhCD40L對(duì)細(xì)胞表達(dá)MMPs和人Ⅰ型膠原α2(Ⅰ)鏈基因啟動(dòng)子的影響。最后從基因、蛋白、酶活性三個(gè)水平觀察rhCD40L對(duì)細(xì)胞表達(dá)COX-2的影響，并探討絲裂酶原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路與rhCD40L誘導(dǎo)COX-2的關(guān)系。總之，通過(guò)以上幾個(gè)部分的研究，以膠原和MMPs為觀察指標(biāo)，探討COX-2與CD40L對(duì)AS斑塊穩(wěn)定性的影響，二者在此過(guò)程中的關(guān)系及

4、其信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，進(jìn)而探討COX-2抑制劑潛在的抗AS作用。 方法 1、高脂飲食法建立兔動(dòng)脈粥樣硬化模型，分為正常組、AS組、阿司匹林治療組、莫比可治療組、阿司匹林+莫比可治療組和他汀治療組，取主動(dòng)脈標(biāo)本行HE染色，并分別進(jìn)行COX-1、COX-2、MMP-2、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原免疫組化染色，觀察不同類(lèi)型COX抑制劑對(duì)AS斑塊中膠原和MMP-2表達(dá)的影響。 2、U937細(xì)胞經(jīng)rhCD40L刺激后，明膠—聚丙烯酰銨凝

5、膠電泳法觀察阿司匹林(100μM)和選擇性COX-2抑制劑NS-398(100μM)對(duì)rhCD40L誘導(dǎo)的U937細(xì)胞表達(dá)MMP-2和MMP-9的影響。 3、人Ⅰ型膠原α2(Ⅰ)鏈基因啟動(dòng)子重組質(zhì)粒pCOLH22.4和pCOLH21.6擴(kuò)增和酶切鑒定后，通過(guò)脂質(zhì)體(Lipofectamin)轉(zhuǎn)染人血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)，rhCD40L刺激轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，ELISA檢測(cè)CAT目的基因表達(dá)以及阿司匹林(100μM)和NS-398(

6、100μM)的影響。 4、U937細(xì)胞經(jīng)rhCD40L不同濃度(0.05、0.1、0.2、0.4μg/ml)和時(shí)間(3、6、12、24小時(shí))刺激后，RT-PCR、Western-blot檢測(cè)rhCD40L誘導(dǎo)COX-2mRNA和蛋白表達(dá)的時(shí)效性和量效性，ELISA檢測(cè)U937細(xì)胞合成的PGE2代表COX-2酶活性；RT-PCR、Western-blot檢測(cè)阿司匹林(100μM)和NS-398(100μM)及普伐他汀(10-2M、

7、10-3M、10-4M)對(duì)COX-2mRNA和蛋白表達(dá)的影響；以PD98059(p42/44MAPK抑制劑)和SB203580(p38MAPK抑制劑)以及磷酸化.JNK抗體、檢測(cè)rhCD40L誘導(dǎo)COX-2的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 結(jié)果 1.COX-2主要在兔AS斑塊處表達(dá)，正常主動(dòng)脈未見(jiàn)COX-2表達(dá)，COX-1在正常動(dòng)脈壁及AS斑塊處均有表達(dá)；與正常動(dòng)脈壁比較，AS斑塊中MMP-2表達(dá)增加，Ⅰ/Ⅲ型膠原比例增加；與AS

8、組比較，阿司匹林組、莫比可組、阿司匹林+莫比可組和他汀治療組AS斑塊中COX-1、COX-2及MMP-2表達(dá)減少，Ⅰ/Ⅲ膠原比例下降；他汀治療組各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于其他3個(gè)治療組，在其他治療組中無(wú)明顯變化。提示COX-2與斑塊易損性有密切關(guān)系，抑制COX-2表達(dá)有可能改善斑塊穩(wěn)定性。 2.rhCD40L刺激U937細(xì)胞可誘導(dǎo)MMP-2和MMP-9表達(dá)；阿司匹林和NS-398對(duì)MMP-2和MMP-9表達(dá)均有明顯的抑制作用(p＜0.05)

9、，二者間無(wú)顯著性差異；NS-398對(duì)rhCD40L誘導(dǎo)的MMP-2和MMP-9表達(dá)的抑制作用更明顯(p＜0.05)。 3.人Ⅰ型膠原α2(Ⅰ)鏈基因啟動(dòng)子重組質(zhì)粒pCOLH22.4和pCOLH21.6擴(kuò)增和酶切鑒定后，通過(guò)脂質(zhì)體(Lipofectamin)轉(zhuǎn)染入血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)，rhCD40L刺激轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CAT目的基因表達(dá)下降；阿司匹林和NS-398均可以增加CAT目的基因表達(dá)，并逆轉(zhuǎn)rhCD4

10、0L誘導(dǎo)的CAT目的基因表達(dá)下降，NS-398的作用強(qiáng)于阿司匹林(p＜0.05)。 4、rhCD40L可誘導(dǎo)COX-2的基因和蛋白表達(dá)、并刺激細(xì)胞合成PGE2、均表現(xiàn)出時(shí)效和量效關(guān)系(p＜0.01)；阿司匹林和NS-398對(duì)COX-2蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響(p＞0.05)；普伐他汀可明顯抑制rhCD40L引起的COX-2mRNA和蛋白表達(dá)；PD98059(25μM)、SB203580(20μM)、以及二者共同作用均使rhCD40L誘

11、導(dǎo)的COX-2蛋白表達(dá)明顯減少(p＜0.01)；rhCD40L刺激后引起活化的JNK蛋白表達(dá)，其時(shí)間窗口為15-120分鐘。 結(jié)論 1、COX-2而非COX-1在AS斑塊中被誘導(dǎo)表達(dá)同時(shí)伴有膠原和MMPs含量變化，提示COX-2與斑塊易損性有密切關(guān)系，抑制COX-2表達(dá)有可能改善斑塊穩(wěn)定性。 2、CD40L和COX-2均可影響膠原和MMPs的表達(dá)，CD40L對(duì)膠原和MMPs的作用部分通過(guò)上調(diào)COX-2實(shí)現(xiàn)，CD4