DNA甲基轉移酶1在同型半胱氨酸致人臍靜脈平滑肌細胞增殖中的作用研究.pdf

1、目的：
　　采用基因重組真核表達質粒pcDNA3.1-DNMT1的方法，觀察轉染DNMT1基因后的表達的變化，探討重組質粒pcDNA3.1-DNMT1是否可以作為靶點影響Hcy引起人臍靜脈平滑肌細胞（HUVSMC）增殖，為臨床治療和預防動脈粥樣硬化（AS）奠定基礎。
　　方法：
　　1.重組質粒pcDNA3.1-DNMT1的構建：抽提HUVSMC中的總RNA，通過逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）合成DNMT1基因，

2、用限制性核酸內切酶EcoRⅠ和XbaⅠ酶切質粒pcDNA3.1(+)和DNMT1基因，瓊脂糖凝膠回收線性化質粒pcDNA3.1(+)和目的基因，純化后回收產物進行連接，將連接產物轉化到大腸桿菌DH5α，搖菌擴增，提取陽性重組質粒，行酶切及DNA測序鑒定。
　　2.重組質粒pcDNA3.1-DNMT1轉染平滑肌細胞：按陽離子脂質體Lipofectamine2000說明操作，分為三組：①轉染pcDNA3.1-DNMT1質粒組；②轉染質

3、粒pcDNA3.1(+)組；③對照組（正常的HUVSMC）。免疫熒光法檢測重組質粒在平滑肌細胞中的表達。再以G418（400μg/mL）篩選兩周后進行試驗。
　　3.重組質粒pcDNA3.1-DNMT1對Hcy致HUVSMC增殖的影響：將重組質粒pcDNA3.1-DNMT1轉染到HUVSMC中，分為3組（n=6）：正常平滑肌細胞組（CON組）、100μmol/LHcy刺激組（Hcy組）、100μmol/LHcy刺激+重組質粒pcD

4、NA3.1-DNMT1轉染組（Hcy+DNMT1組）。然后用細胞計數(shù)法、MTT法繪制細胞生長曲線，檢測平滑肌細胞的增殖情況，并用RT-PCR檢測DNMT1基因的表達量。
　　結果：
　　1.成功構建重組質粒pcDNA3.1-DNMT1：構建的重組質粒pcDNA3.1(+)-DNMT1酶切后能夠得到預期的片段，證實其正確性；經生物公司測序所得結果與GenBank公布的序列進行BLAST比對，同源性為100％。
　　2.重

5、組質粒pcDNA3.1-DNMT1的轉染：在熒光顯微鏡下觀察，重組質粒轉染HUVSMC后可見綠色熒光，而其他兩組沒有。
　　3.重組質粒pcDNA3.1-DNMT1轉染入HUVSMC對Hcy致HUVSMC增殖有抑制作用：生長實驗顯示Hcy組較CON組平滑肌細胞生長速度增快（P<0.05），Hcy+DNMT1組較Hcy組平滑肌細胞生長速度減慢（P<0.05）。說明轉染重組質粒pcDNA3.1-DNMT1后可能對Hcy致HUVSMC增

6、殖起抑制作用。RT-PCR實驗結果顯示Hcy組較CON組DNMT1mRNA表達含量低（P<0.05），而Hcy+DNMT1組較Hcy組DNMT1mRNA表達含量高（P<0.05）。說明Hcy作用可以導致平滑肌細胞DNMT1mRNA表達含量下降，重組質粒pcDNA3.1-DNMT1轉染Hcy致HUVSMC增殖的模型后可能使DNMT1mRNA表達含量增高。
　　結論：
　　1.成功構建重組表達質粒pcDNA3.1-DNMT1。<