DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1在同型半胱氨酸致人臍靜脈平滑肌細(xì)胞增殖中的作用研究.pdf

1、目的：
　　采用基因重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-DNMT1的方法，觀察轉(zhuǎn)染DNMT1基因后的表達(dá)的變化，探討重組質(zhì)粒pcDNA3.1-DNMT1是否可以作為靶點(diǎn)影響Hcy引起人臍靜脈平滑肌細(xì)胞（HUVSMC）增殖，為臨床治療和預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化（AS）奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.重組質(zhì)粒pcDNA3.1-DNMT1的構(gòu)建：抽提HUVSMC中的總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）合成DNMT1基因，

2、用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ酶切質(zhì)粒pcDNA3.1(+)和DNMT1基因，瓊脂糖凝膠回收線性化質(zhì)粒pcDNA3.1(+)和目的基因，純化后回收產(chǎn)物進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，搖菌擴(kuò)增，提取陽性重組質(zhì)粒，行酶切及DNA測(cè)序鑒定。
　　2.重組質(zhì)粒pcDNA3.1-DNMT1轉(zhuǎn)染平滑肌細(xì)胞：按陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000說明操作，分為三組：①轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-DNMT1質(zhì)粒組；②轉(zhuǎn)染質(zhì)

3、粒pcDNA3.1(+)組；③對(duì)照組（正常的HUVSMC）。免疫熒光法檢測(cè)重組質(zhì)粒在平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)。再以G418（400μg/mL）篩選兩周后進(jìn)行試驗(yàn)。
　　3.重組質(zhì)粒pcDNA3.1-DNMT1對(duì)Hcy致HUVSMC增殖的影響：將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-DNMT1轉(zhuǎn)染到HUVSMC中，分為3組（n=6）：正常平滑肌細(xì)胞組（CON組）、100μmol/LHcy刺激組（Hcy組）、100μmol/LHcy刺激+重組質(zhì)粒pcD

4、NA3.1-DNMT1轉(zhuǎn)染組（Hcy+DNMT1組）。然后用細(xì)胞計(jì)數(shù)法、MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，檢測(cè)平滑肌細(xì)胞的增殖情況，并用RT-PCR檢測(cè)DNMT1基因的表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-DNMT1：構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-DNMT1酶切后能夠得到預(yù)期的片段，證實(shí)其正確性；經(jīng)生物公司測(cè)序所得結(jié)果與GenBank公布的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，同源性為100％。
　　2.重

5、組質(zhì)粒pcDNA3.1-DNMT1的轉(zhuǎn)染：在熒光顯微鏡下觀察，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVSMC后可見綠色熒光，而其他兩組沒有。
　　3.重組質(zhì)粒pcDNA3.1-DNMT1轉(zhuǎn)染入HUVSMC對(duì)Hcy致HUVSMC增殖有抑制作用：生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)顯示Hcy組較CON組平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)速度增快（P<0.05），Hcy+DNMT1組較Hcy組平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢（P<0.05）。說明轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-DNMT1后可能對(duì)Hcy致HUVSMC增

6、殖起抑制作用。RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Hcy組較CON組DNMT1mRNA表達(dá)含量低（P<0.05），而Hcy+DNMT1組較Hcy組DNMT1mRNA表達(dá)含量高（P<0.05）。說明Hcy作用可以導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞DNMT1mRNA表達(dá)含量下降，重組質(zhì)粒pcDNA3.1-DNMT1轉(zhuǎn)染Hcy致HUVSMC增殖的模型后可能使DNMT1mRNA表達(dá)含量增高。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-DNMT1。<