哺乳動物起始性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶在基因沉默中的作用及機(jī)理研究.pdf

1、多細(xì)胞生物的生長發(fā)育、組織特化以及對環(huán)境變化的響應(yīng)在很大程度上依賴于基因的選擇性表達(dá)。基因的沉默除了受到轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的調(diào)節(jié)外，還受到DNA甲基化和組蛋白修飾的影響。在哺乳動物發(fā)育過程中，細(xì)胞基因組DNA需要在特定的時間和特定的位點(diǎn)進(jìn)行精確的甲基化譜式的建立，從而對外界環(huán)境的變化作出正確的響應(yīng)，存此過程中起始性 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶 Dnmt3a 和 Dnmt3b 起著重要的作用。然而，Dnmt3a和Dnmt3b在基因甲基化譜式建立中的分子

2、機(jī)制還不清楚。 在利用體外細(xì)胞分化系統(tǒng)證實(shí)Oct4基因在體外細(xì)胞分化過程中發(fā)生了起始性的甲基化，并發(fā)現(xiàn)其 DNA 甲基化主要發(fā)生在啟動子和近端增強(qiáng)子區(qū)域，而不發(fā)生在遠(yuǎn)端增強(qiáng)子區(qū)域。為了研究Oct4基因發(fā)生起始性DNA甲基化的分子機(jī)理，首先鑒定了參與這一過程的 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶。分別或同時針對Dnmt3a 和 Dnmt3b的 siRNA 干擾以及功能缺失能夠?qū)е翺ct4基因在細(xì)胞分化過程中的低甲基化、轉(zhuǎn)錄異常激活以及細(xì)胞分化異常

3、，提示了 Dnmt3a 和 Dnmt3b在 Oct4 基因甲基化中的協(xié)同作用。免疫共沉淀、哺乳動物細(xì)胞雙雜交以及細(xì)胞免疫熒光等實(shí)驗(yàn)證明Dnmt3a 和 Dnmt3b在體內(nèi)能夠相互作用形成異聚體，并在ES 細(xì)胞中有相互重疊的亞細(xì)胞定位。通過染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Dnmt3a 和 Dnmt3b 在正在分化的細(xì)胞中能夠定位在Oct4的甲基化區(qū)域。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步說明Dnmt3a和Dnmt3b不僅能夠相瓦作用，而且它們在細(xì)胞分化早期協(xié)同作用于

4、Oct4基因時能夠快速有效地將其甲基化，從而保持穩(wěn)定的、長時間的基因沉默；同時，也顯示了Oct4基因的甲基化對細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育所具有的重要作用。此外，還檢測了其他一些基因在細(xì)胞分化前后的甲基化狀態(tài)。幾個神經(jīng)元特異性表達(dá)的基兇，如Tubb3、NFL以及c-Jun等，不論在未分化的P19細(xì)胞還是在分化以后的細(xì)胞中都沒有被甲基化。而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志性基因Gfap則在分化過程中發(fā)生了去甲基化。除此之外，本工作還檢測了Rasgrfl、Gtl2

5、和H19三個父本印跡基因是否在小鼠 E12.5 天的原始生殖細(xì)胞中發(fā)生去甲基化，以及它們的父本甲基化譜式在何時開始建立。同時，也將Rasgrfl和Gtl2同另一個父本印跡基因H19以及母本印跡基因Snrpn進(jìn)行了比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Rasgrfl、H19以及Snrpn的甲基化在 E12.5 天被抹去，而Gtl2的甲基化水平雖然在此時達(dá)到最低值，但是仍有一部分處于甲基化的狀態(tài)。在雄性生殖系中，Rasgfl、Gtl2以及H19的起始性甲基化