快速靈敏檢測熱原的穩(wěn)定細胞系的開發(fā)與研究.pdf

1、熱原是一類在宿主體內(nèi)可以引起發(fā)熱和誘導炎癥反應的異構類化合物。在臨床上，熱原是指能使哺乳動物產(chǎn)生熱原反應的物質。熱原按照來源分為外源性熱原和內(nèi)源性熱原。外源性熱原主要來源于機體外，分別為微生物（如細菌、病毒、真菌）與非微生物（如抗原、抗腫瘤藥）性熱原，內(nèi)源性熱原主要包括機體內(nèi)的激素（如類固醇、前列腺素）與細胞因子（如腫瘤壞死因子、干擾素、生長因子、白介素）。使用熱原污染的藥品和醫(yī)療器械會引起系統(tǒng)性炎癥，在最糟糕的情況下，則會引起敗血性休

2、克。因此，準確和快速量化熱原對藥品安全是至關重要的。到目前為止，家兔法、鱟試劑法和單核細胞激活試驗檢測法對于熱原的檢測都存在限制。在我們的研究中，我們致力于開發(fā)一種利用熒光素酶報告系統(tǒng)來靈敏、可靠、快速地檢測熱原的方法。
　　先前的報道已經(jīng)表明，細菌鞭毛蛋白可以通過Toll樣受體TLR5刺激人肺泡上皮細胞產(chǎn)生細胞因子IL-8。然而，其他的熱原物質是如何誘導激活肺上皮細胞還沒有完全被闡釋清楚。脂多糖（LPS，也被稱為內(nèi)毒素）作為最主

3、要的熱原，是細胞因子最有效的細菌誘導劑之一。在感染過程中，熱原刺激人的單核細胞去合成或者釋放炎癥細胞因子，包括白介-1β，白介-6，腫瘤壞死因子-α。而NF-κB是調(diào)控編碼這些促炎因子基因的主要轉錄因子。與此同時，人類β-干擾素(IFN-β)通過增強TNF依賴的TNF的產(chǎn)生，顯著性增加了正常家兔對內(nèi)毒素的發(fā)熱反應，而且也恢復了致敏原耐受的家兔對內(nèi)毒素的正常發(fā)熱反應。鑒于此，我們把含有NF-κB應答元件或者IFN-β啟動子的熒光素酶基因插

4、入到慢病毒載體中，然后穩(wěn)定轉染到A549細胞中，再經(jīng)過流式分選單克隆，最后利用熒光素酶報告系統(tǒng)來鑒定單克隆細胞的活性，從而構建出穩(wěn)定的人A549熒光素酶報告細胞系。
　　我們的結果表明幾株NF-κB單克隆穩(wěn)定細胞對0.1EU/mL的內(nèi)毒素響應，而這是少于人的發(fā)熱閾值0.3EU/mL內(nèi)毒素的。我們進一步使用靈敏度為0.125EU/mL的鱟試劑與報告細胞比較，這是藥物中廣泛使用的鱟試劑靈敏度，以評估相同條件下的熱原，結果顯示報告細胞達