1、缺血后處理對(duì)大鼠移植肝缺血再灌注損傷的保護(hù)作用;2、沉默樹突狀細(xì)胞CD40基因以誘導(dǎo)免疫耐受的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、1.缺血后處理對(duì)大鼠移植肝缺血再灌注損傷的保護(hù)作用
　　在大多數(shù)肝臟外科疾患的手術(shù)過程（例如嚴(yán)重的肝外傷、肝葉切除、肝移植等）中，缺血再灌注損傷是一個(gè)普遍存在的病理現(xiàn)象。盡管隨著器官保存、外科手術(shù)技術(shù)、圍手術(shù)期處理水平和免疫抑制劑的不斷改進(jìn)和提高，肝移植已成為眾多慢性、進(jìn)行性、不可逆性肝病的有效治療方法；但肝移植術(shù)后可能出現(xiàn)的肝功能衰竭、移植排斥反應(yīng)、膽道狹窄、血栓等并發(fā)癥始終困擾著醫(yī)務(wù)工作者。特別是肝移植過程中不可避免的缺血再灌

2、注損傷是導(dǎo)致早期移植肝功能不良（poorearlygraftfunction,PEGF）或原發(fā)性無功能(primarynonfunction,PNF)的重要原因，因此，研究者們不遺余力地去研究潛在的相關(guān)機(jī)制并探索各種可能的保護(hù)性方法。缺血再灌注損傷的病理生理學(xué)機(jī)制十分復(fù)雜且具體過程并未明了，但可以確定的是多種作用機(jī)制參與其中，包括炎性細(xì)胞因子的合成和釋放，中性粒細(xì)胞的聚集與浸潤(rùn)，氧自由基的釋放，能量代謝的障礙、鈣平衡障礙等。缺血預(yù)處理對(duì)

3、缺血再灌注損傷所起的保護(hù)作用已在多種器官和動(dòng)物模型乃至臨床上得到了證明。但由于大多數(shù)供肝來源于腦死亡供體，其在肝移植上的應(yīng)用有很大的局限性。研究發(fā)現(xiàn)，缺血后處理具有和預(yù)處理相似作用，能夠減輕缺血再灌注損傷所造成的心室纖顫、減少心肌梗死面積。在本研究中，我們通過建立同品系大鼠肝移植模型，研究缺血后處理對(duì)移植肝缺血再灌注損傷的保護(hù)作用并探討其作用機(jī)制。
　　目的：建立同品系大鼠肝移植動(dòng)物模型，研究缺血后處理對(duì)大鼠移植肝缺血再灌注損傷的

4、保護(hù)作用及其作用機(jī)制，并觀察不同后處理循環(huán)次數(shù)對(duì)作用效果的影響，以期為減輕肝移植后缺血再灌注損傷提供新的方法。
　　方法：健康雄性Spraque-Dawley大鼠，體重280-320g，隨機(jī)分為4組，（1）假手術(shù)組（shamoperatedgroup/SO，n=6）：僅行開關(guān)腹手術(shù)；（2）缺血再灌注損傷組（ischemiareperfusiongroup/IR，n=6）：以“二袖套”法行肝移植術(shù)；（3）后處理1組（ischemic

5、postconditioning1group/IPostC1，n=6）：手術(shù)方法同IR組，但在門靜脈完全再通前，以無損傷小動(dòng)脈夾給予門靜脈30s再通-30s阻斷，共循環(huán)3次；（4）后處理2組（ischemicpostconditioning2group/IPostC2，n=6）：處理方法同IPostC1組，但將供肝植入后門靜脈完全再通前的復(fù)灌復(fù)停循環(huán)次數(shù)增至6次。再灌注后6小時(shí)，各組受體經(jīng)下腔靜脈抽血并留取肝臟，血樣離心后取部分上清用全

6、自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT、AST及LDH；部分上清置于-20℃冰箱保存，待測(cè)TNF-α水平；稱取2g肝組織4℃下以勻漿器研磨為10％的組織勻漿，-20℃冰箱保存待測(cè)GSH-PX、MDA、MPO、SOD、NO含量；取各組肝中葉組織以4％多聚甲醛固定24h，常規(guī)石臘包埋，連續(xù)5um切片，HE染色后利用HPIAS-100圖像分析系統(tǒng)分析損傷壞死區(qū)域比例。
　　結(jié)果：（1）供體手術(shù)時(shí)間30.1±3.26min，供肝準(zhǔn)備時(shí)間17.3±2.1

7、4min，受體手術(shù)時(shí)間46.4±3.60min，無肝期18.5±1.62min，手術(shù)總成功率達(dá)到75％，手術(shù)失敗的主要原因?yàn)槲呛峡诔鲅?、吻合口狹窄及血栓形成；（2）與SO組相比，IR組的ALT、AST和LDH均明顯升高，而兩后處理組ALT、AST和LDH水平較IR組明顯降低，后處理組間無顯著差異；（3）IR組肝組織MDA含量較SO組迅速增高而SOD和GSH-PX活力顯著降低；IPostC1與IPostC2組MDA含量顯著下降，而抗氧化酶

8、活力顯著提高，兩后處理組間未見顯著差異；（4）IR組MPO水平顯著增高，IPostC1與IPostC2組肝內(nèi)MPO水平顯著下降，兩后處理組間無顯著差異；（5）與SO組相比，IR組血清TNF-α水平顯著增高；IPostC1和IPostC2組血清TNF-α水平較IR組明顯下降，兩后處理組間無顯著差異；（6）與SO組相比，IR組血清NO含量升高，兩后處理組與IR組相比，NO含量進(jìn)一步升高，兩后處理組間無顯著差異；（7）光鏡下發(fā)現(xiàn)IR組肝組織切

9、片中可見肝竇間隙紊亂，肝細(xì)胞壞死，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)以及出血，后處理各組小葉結(jié)構(gòu)保存良好，有少量出血和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，與IR組相比，肝組織損傷壞死面積明顯減少。
　　結(jié)論：（1）以改良“二袖套”法成功建立了大鼠原位肝移植動(dòng)物模型，并與“三袖套”法進(jìn)行了比較，證明前者手術(shù)時(shí)間略長(zhǎng)但成功率高，后者手術(shù)時(shí)間短但成功率低；（2）缺血后處理對(duì)大鼠移植肝缺血再灌注損傷具有明顯的保護(hù)作用；（3）缺血后處理可能通過增強(qiáng)NO合成和減輕中性粒細(xì)胞激活浸潤(rùn)

10、程度發(fā)揮其保護(hù)性作用；（4）簡(jiǎn)單的增加循環(huán)次數(shù)并不能增強(qiáng)缺血后處理的保護(hù)性效果；（5）該方法實(shí)施簡(jiǎn)單可行，有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　2.沉默樹突狀細(xì)胞CD40基因以誘導(dǎo)免疫耐受的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　移植排斥反應(yīng)始終是困擾組織器官移植的一大難題，應(yīng)用免疫抑制藥物并不能有效地控制排斥反應(yīng)，且受者術(shù)后需長(zhǎng)期服藥。但免疫抑制劑均有其毒副作用，長(zhǎng)期使用會(huì)降低受者全身免疫功能，從而增加發(fā)生機(jī)會(huì)性感染和腫瘤的危險(xiǎn)。最理想的解決方法是誘導(dǎo)受

11、體對(duì)供體組織器官的免疫耐受。樹突狀細(xì)胞(Dendriticcell，DC)是目前已知的功能最強(qiáng)的專職抗原呈遞細(xì)胞(APC)，能夠激活幼稚T細(xì)胞（NaiveTcells）、啟動(dòng)初次免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)免疫激活和免疫耐受的平衡，在免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。CD40是CD40L的受體，廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞（DC、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等）表面。在免疫應(yīng)答過程中，T細(xì)胞的功能性活化需要兩類信號(hào)協(xié)同作用才能完成，DC除了為T細(xì)胞提供MHC-抗原復(fù)合

12、物（第一信號(hào)）以外，成熟DC表達(dá)高水平B7-1、B7-2和CD40共刺激分子，為T細(xì)胞活化提供協(xié)同刺激信號(hào)（第二信號(hào)）。CD28-B7和CD40-CD40L均能獨(dú)立提供第二信號(hào)，但CD40-CD40L的結(jié)合為更為早期的分子事件，它的結(jié)合可以上調(diào)CD28、B7分子的表達(dá)，從而促進(jìn)CD28-B7的結(jié)合。RNA干涉（RNAinterference，RNAi）是近年發(fā)展起來的基因特異性沉默技術(shù)，其本質(zhì)是一種廣泛存在于高等植物和動(dòng)物中的由雙鏈RN

13、A介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉寂（posttranscriptionalgenesilencing,PTGS）現(xiàn)象。與反義技術(shù)、核酶技術(shù)以及抗體介導(dǎo)的基因表達(dá)沉默技術(shù)相比，RNAi具有高效、特異等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于基因功能和基因治療等研究中。本研究擬利用RNAi技術(shù)特異性沉默大鼠骨髓源性DC的CD40表達(dá)，觀察轉(zhuǎn)染后DC的表型及其刺激同種異體T淋巴細(xì)胞增殖能力的變化，為將RNAi應(yīng)用于“耐受性DC”的制備和組織器官移植免疫耐受的誘導(dǎo)提供新的思

14、路。
　　目的：建立體外誘導(dǎo)、擴(kuò)增大鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞的方法，并觀察其表型及功能特性；利用高效的pSilencer4.1-CMVneoVector構(gòu)建針對(duì)大鼠CD40的小干擾RNA真核表達(dá)載體，觀察轉(zhuǎn)染骨髓來源DC后對(duì)其細(xì)胞表型及免疫功能的影響。
　　方法：利用Ambion公司的網(wǎng)上設(shè)計(jì)工具，設(shè)計(jì)2個(gè)靶向CD40基因的發(fā)夾狀siRNA，通過化學(xué)合成的方法合成2對(duì)分別互補(bǔ)的寡核苷酸鏈，退火后將雙鏈DNA片段連接至pSilen

15、cer4.1-CMVneovector的多克隆位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化擴(kuò)增提取質(zhì)粒，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ和HindⅢ雙酶切電泳鑒定和DNA序列分析鑒定。取得大鼠骨髓細(xì)胞后，去除紅細(xì)胞，加入重組大鼠粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rrGM-CSF）、重組大鼠白細(xì)胞介素4（rrIL-4）培養(yǎng)2周；在光鏡和掃描電鏡下觀察培養(yǎng)DC的形態(tài)學(xué)特征，流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面MHC-Ⅱ、CD80、CD86的表達(dá)水平，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)其刺激同種T細(xì)胞增殖能力。于培

16、養(yǎng)第6天，共分4組進(jìn)行轉(zhuǎn)染：（1）空轉(zhuǎn)染組：僅加入轉(zhuǎn)染試劑；（2）陰性對(duì)照組：陰性對(duì)照pSilencer4.1-CMVneonegativecontrol轉(zhuǎn)染組；（3）pS-CD40A轉(zhuǎn)染組；（4）pS-CD40B轉(zhuǎn)染組。經(jīng)腫瘤壞死因子(tumournecrosisfactor,TNF)-α和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)繼續(xù)誘導(dǎo)成熟48h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面分子CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表達(dá)情況，逆轉(zhuǎn)

17、錄多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）及westernblot檢測(cè)沉默效果，免疫熒光檢測(cè)CD40表達(dá)情況，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-10和IL-12水平；混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后DC刺激同種T淋巴細(xì)胞增殖能力。
　　結(jié)果：（1）經(jīng)雙酶切電泳鑒定和DNA序列分析鑒定，目的片段與pSilencer4.1-CMVneovector連接正確，靶向大鼠CD40基因的siRNA重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功；（2）細(xì)胞培養(yǎng)8天后，經(jīng)倒置顯微鏡和電鏡觀察

18、DC出現(xiàn)典型形態(tài)，培養(yǎng)6天的DC具有不成熟表型，流式細(xì)胞儀檢測(cè)MHC-Ⅱ表達(dá)為29.1％、CD80為21.9％，CD86為25.2％，刺激同種T細(xì)胞增殖能力較低，而培養(yǎng)12天DC的MHC-Ⅱ表達(dá)為76.2％、CD80為80.7％，CD86為82.4％，刺激同種T細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)；（3）轉(zhuǎn)染后各組DC表面共刺激分子MHC-Ⅱ、CD80和CD86表達(dá)結(jié)果無明顯差異；（4）RT-PCR顯示pS-CD40A轉(zhuǎn)染組CD40mRNA條帶表達(dá)明顯

19、減弱，而空轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組、pS-CD40B組間比較無明顯差異；（5）Western-blot結(jié)果顯示pS-CD40A轉(zhuǎn)染組DC的CD40蛋白表達(dá)被明顯抑制，而空轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組、pS-CD40B組間比較無明顯差異；（6）pS-CD40A組細(xì)胞熒光強(qiáng)度較空轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組和pS-CD40B組明顯減弱；（7）ELISA檢測(cè)各組DC培養(yǎng)上清IL-10和IL-12細(xì)胞因子濃度，結(jié)果顯示pS-CD40A組IL-10較其他組明顯增加，而IL

20、-12水平顯著減少；（8）MLR結(jié)果顯示pS-CD40A組轉(zhuǎn)染后DC的共刺激能力較其余各組明顯減弱。
　　結(jié)論：（1）成功構(gòu)建大鼠CD40基因的RNA干擾真核表達(dá)載體；（2）成功建立大鼠骨髓來源DC的培養(yǎng)方法，大鼠骨髓干細(xì)胞經(jīng)rrGM-CSF、rrIL-4誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后得到具有典型形態(tài)特征及功能的DC；（3）pS-CD40A能夠有效沉默DC表面CD40表達(dá)，轉(zhuǎn)染后DC的IL-12表達(dá)水平明顯降低，而IL-10表達(dá)水平升高，刺激同種