基因comE對(duì)肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化率影響機(jī)制的研究.pdf

1、轉(zhuǎn)化是細(xì)菌基因重組最常見的方式之一，轉(zhuǎn)化的結(jié)果可使細(xì)菌的染色體整合上外源DNA，從而使其某些生物學(xué)特征發(fā)生變化，并能代代遺傳。大量研究證明細(xì)菌的轉(zhuǎn)化與其進(jìn)化、毒力因子和耐藥性等生物學(xué)性狀的表達(dá)密切相關(guān)。同時(shí)轉(zhuǎn)化也成為實(shí)驗(yàn)室對(duì)細(xì)菌進(jìn)行基因改造的一個(gè)簡(jiǎn)便而重要工具。 肺炎鏈球菌可以在自然生長(zhǎng)狀態(tài)下產(chǎn)生感受態(tài)而發(fā)生轉(zhuǎn)化，即自然轉(zhuǎn)化；其感受態(tài)也可通過感受態(tài)刺激因子（competence-stimulating peptide，CSP）誘

2、導(dǎo)產(chǎn)生，即誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化。目前調(diào)控肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化的基本分子網(wǎng)絡(luò)已清楚，但肺炎鏈球菌在不同生長(zhǎng)階段、不同濃度CSP誘導(dǎo)時(shí)的轉(zhuǎn)化率差別很大，其分子機(jī)制尚不清楚。操縱子comCDE是調(diào)控肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化發(fā)生的關(guān)鍵基因，其中comE為該操縱子發(fā)揮作用的效應(yīng)蛋白，細(xì)菌不同轉(zhuǎn)化率的發(fā)生是否就是該基因表達(dá)變化的直接結(jié)果呢？我們的研究思路是：首先缺陷基因comE，以驗(yàn)證基因comE在細(xì)菌轉(zhuǎn)化中的關(guān)鍵作用，然后分別探討CSP誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化和自然轉(zhuǎn)化中不同轉(zhuǎn)化率的發(fā)生與

3、該基因的相關(guān)性，并通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法初步探索其調(diào)控機(jī)制。本研究包括以下三個(gè)部分： 1.comE基因?qū)Ψ窝祖溓蚓D(zhuǎn)化的影響。構(gòu)建comE基因缺陷菌株，比較野生菌株和缺陷菌株的自然轉(zhuǎn)化率及CSP誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化率，結(jié)果顯示comE基因缺陷菌株的自然轉(zhuǎn)化率和CSP誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化率為0，提示基因comE為細(xì)菌自然轉(zhuǎn)化和CSP誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化所必需。 2.探討肺炎鏈球菌在不同生長(zhǎng)時(shí)間的自然轉(zhuǎn)化率與comE基因表達(dá)變化的相關(guān)性。通過熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)

4、comE基因在細(xì)菌不同時(shí)期的mRNA表達(dá)水平，并測(cè)定對(duì)應(yīng)的細(xì)菌轉(zhuǎn)化率。結(jié)果顯示細(xì)菌在整個(gè)生長(zhǎng)過程中只有一個(gè)轉(zhuǎn)化率高峰，約在菌密度為A550=0.3左右；而基因comE的mRNA表達(dá)則有2～3個(gè)高峰期，與細(xì)菌不同轉(zhuǎn)化率的發(fā)生無(wú)顯著相關(guān)性（r<0.3），提示可能存在基因comE以外的其他因子與細(xì)菌的自然轉(zhuǎn)化率直接相關(guān)。 3.探討不同濃度CSP誘導(dǎo)細(xì)菌發(fā)生的不同轉(zhuǎn)化率與comE基因表達(dá)變化的相關(guān)性。通過熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)comE基

5、因在不同濃度CSP誘導(dǎo)時(shí)、不同時(shí)期的mRNA表達(dá)水平，并測(cè)定對(duì)應(yīng)的細(xì)菌轉(zhuǎn)化率。結(jié)果顯示（1）comE的mRNA表達(dá)水平在100μg/L CSP誘導(dǎo)后10min顯著上升，之后迅速下降，其轉(zhuǎn)化率與其comE的基礎(chǔ)表達(dá)顯著相關(guān)（r>0.99），提示在該CSP濃度下，細(xì)菌的不同轉(zhuǎn)化率發(fā)生與comE的基礎(chǔ)表達(dá)量相關(guān)。（2）10μg/L、100μg/L和1000μg/L的CSP誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化時(shí)，細(xì)菌的轉(zhuǎn)化率沒有隨其濃度的增加而升高，comE只在100μg

6、/L的CSP誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)量增加，表明細(xì)菌不同轉(zhuǎn)化率發(fā)生及comE的誘導(dǎo)表達(dá)量變化與CSP不存在明顯濃度依賴性，提示存在CSP以外的其他因子調(diào)控基因comE的表達(dá)及細(xì)菌的轉(zhuǎn)化，且可能存在基因comE以外的其他因子與細(xì)菌的轉(zhuǎn)化率直接相關(guān)。 為了探尋細(xì)菌轉(zhuǎn)化可能的調(diào)控機(jī)制，我們應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)（雙向電泳結(jié)合MALDI-TOF-MS）對(duì)肺炎鏈球菌感受態(tài)發(fā)生到關(guān)閉這一時(shí)間段內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行比較，從蛋白水平分析了其發(fā)生不同轉(zhuǎn)化率的分子機(jī)制