血管性血友病分型組合實驗的建立和臨床應用.pdf

1、目的：(1)建立表達重組糖蛋白Iba活性片段(rGPIba H1-V289)細胞株，并且純化其表達產物，研究其生物學功能。 (2)通過rGPIba表達產物建立一種新的檢測VWF:RCO的酶聯免疫吸附(ELISA)方法，并探討其在血管性血友病診斷中的應用價值。 (3)比較VWF在正常人組不同ABO血型個體間質和量的差異。(4)建立一套系統(tǒng)的檢測VWD的診斷和分型組合實驗方法，為VWD的診斷和分型提供更準確的實驗室依據。

2、 方法： (1)利用脂質體將含有編碼GPIba H1-V289 DNA質粒pCMV3轉染CHO細胞，用親和層析法純化重組片段。 (2)以抗GPIba的單克隆抗體2D4-IgG為包被抗體捕獲r GPIba，建立VWF：RCO-ELISA法。同時對其敏感性、重復性作方法學評估，并與血小板凝聚法檢測VWF：RCO進行比較。 (3)采用ELISA法檢測正常人組(不同ABO血型)、VWD組及其它出血性疾病組血漿VWF：

3、Ag、VWF:CB、VWF：RCO、VWF：FVⅢB，采用智能血液凝集儀檢測RIPA水平，采用非連續(xù)緩沖體系的瓊脂糖凝膠電泳進行VWF多聚物分析。 結果： (1)經轉染的CHO細胞培養(yǎng)上清含有高表達的rGPIba，純化重組片段能抑制瑞斯托霉素誘導的血小板聚集功能。 (2)運用ELISA法檢測VWF：RCO，VWD患者組與正常人組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.0001)；其它出血性疾病組與正常組比較，差異無統(tǒng)計學

4、差異(P>0.05)，該法測定的批內和批間變異分別為5.4％和9.4％。血小板凝聚法檢測VWF：RCO其批內和批間變異分別為17.8％和18.3％。 (3)O型血個體其VWF，Ag、VWE:RCO及VWF，CB均低于非O型血，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.001)。 (4)采用PLT和APTT作為VWD的篩選試驗，VWF、Ag、VWF:CB和VWF：RCO-ELISA為確診試驗，RIPA、VWF：FVmB和多聚物分析為分

5、型試驗。 結論：(1)CHO細胞株能恒定表達rGPIbaH1-V289，重組片段具有較高的純度、免疫學活性和生物學活性。 (2)VWF：RCO-ELISA法操作簡便，特異性、敏感性和重復性均較好；通過VWF：RCO/Ag可以鑒別1型、2型及3型血管性血友病(VWD)患者。 (3)O型血較非O型血個體有更高的出血傾向，在臨床診斷VWD的過程中要充分考慮ABO血型系統(tǒng)對血漿VWF水平的影響。 (4)本研究所建