白草花葉病毒P1基因生物學(xué)功能的研究及轉(zhuǎn)激活蛋白基因煙草的培育.pdf

1、本研究通過將白草花葉病毒P1基因轉(zhuǎn)化本生煙，并利用植物病毒載體PVX將此基因?qū)氡旧鸁熡^察癥狀變化推測P1蛋白的生物學(xué)功能。將白草花葉病毒的P1基因連接到中間載體pRT103上，獲得重組子pRT103P1，用PstⅠ單酶切后獲得帶有35S啟動子的P1基因，插入到植物表達載體pCAMBIA1301上，獲得重組質(zhì)粒pCAM1301P1，并將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，利用葉盤法轉(zhuǎn)化本生煙，獲得了具有潮霉素抗性的再生植株。

2、 分子檢測結(jié)果表明22株中有3株為轉(zhuǎn)P1基因陽性植株。陽性植株與野生型植株相比生長較弱，葉片比野生型的小。因此，白草花葉病毒P1基因?qū)Ρ旧鸁煹纳L發(fā)育可能有不利影響。轉(zhuǎn)P1基因陽性植株的獲得為進一步研究該基因的功能提供了條件。 將白草花葉病毒P1基因插入PVX載體，在體外轉(zhuǎn)錄后接種本生煙，觀察癥狀表現(xiàn)。接種PVX空載體作為對照的植株表現(xiàn)輕微系統(tǒng)花葉癥狀，而接種pPVXP1的本生煙葉片出現(xiàn)斑駁和壞死斑，新生葉片表現(xiàn)畸形，癥狀明顯比

3、對照嚴重，推測白草花葉病毒P1基因可能參與對PVX的協(xié)生作用，增強了PVX的致病性。接種pPVXP1的植株比對照發(fā)病延遲，可能是由于白草花葉病毒P1蛋白的表達減緩了PVX病毒粒子的系統(tǒng)運動。 前人的研究表明，從真菌中克隆出的激活蛋白基因產(chǎn)物有抗病毒作用，擴增激活蛋白基因，插入植物雙元表達載體pCAMBIA1301，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草，在含有潮霉素的培養(yǎng)基上篩選抗性植株。在MS培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)兩天，在MSI上約三周后分化出小芽

4、，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基MSⅡ誘導(dǎo)生根。 本實驗共獲得100多個再生植株，對其中30個再生植株的PCR和RT-PCR檢測結(jié)果表明29株為陽性，轉(zhuǎn)化率高達96.7％。取轉(zhuǎn)基因陽性植株接種TMV，一周后野生型普通煙及轉(zhuǎn)基因陽性植株都出現(xiàn)花葉，但是與野生型植株相比，轉(zhuǎn)激活蛋白基因的植株褪綠較輕微，一個月后癥狀加重，但與野生型相比葉片仍然只表現(xiàn)褪綠而不黃化。轉(zhuǎn)激活蛋白基因煙草植株的獲得為進一步研究此蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)，對培育煙草抗病品種也有重