5Fu對(duì)乳腺癌細(xì)胞向腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞逆向分化的作用.pdf

1、乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,嚴(yán)重影響婦女的身心健康甚至危及生命,且其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升及年輕化的趨勢(shì)。目前乳腺癌的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明,國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究認(rèn)為乳腺癌是一種腫瘤干細(xì)胞疾病。乳腺癌干細(xì)胞(BCSCs)可能是乳腺癌發(fā)生及治療后復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的根源。因此,徹底去除乳腺癌干細(xì)胞有可能徹底治愈乳腺癌,但是,乳腺癌干細(xì)胞只占乳腺癌的極少一部分,目前的關(guān)鍵是尋找高效分離和鑒定乳腺癌干細(xì)胞的方法。
　　 越來(lái)越多的證據(jù)支持腫瘤干

2、細(xì)胞假說(shuō),目前的腫瘤干細(xì)胞假說(shuō)認(rèn)為:腫瘤是由具有自我更新,多系分化,腫瘤形成能力等特性的腫瘤干細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的。腫瘤干細(xì)胞可以自我更新,但其缺乏處穩(wěn)能力,可以無(wú)限制生長(zhǎng)；可以多系分化,但缺乏分化成熟的能力。乳腺癌干細(xì)胞的不對(duì)稱(chēng)分裂使其每分裂一次產(chǎn)生一個(gè)與自己相同的干細(xì)胞和一個(gè)具有朝向某個(gè)方向分化和分裂增生能力的祖細(xì)胞,由于兩者在實(shí)踐中難以區(qū)分,統(tǒng)稱(chēng)為乳腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞(SLC)。CD44+／CD24-作為乳腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的標(biāo)志之一逐漸獲得公

3、認(rèn)。CD44+／CD24-／ESA+細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的腫瘤干細(xì)胞的特征,如可在體外自我更新、并能重新形成其親代細(xì)胞系、細(xì)胞周期更慢、分裂緩慢、少數(shù)細(xì)胞致瘤及對(duì)化療抵抗。在腔細(xì)胞系如MCF7中,ESA+接近100％,因此,分選CD44+CD24-表型的細(xì)胞可富集腫瘤干細(xì)胞。
　　 腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的數(shù)量并非恒定,而是在極大的范圍內(nèi)波動(dòng)。這種數(shù)量波動(dòng)可以被認(rèn)為是普通細(xì)胞與干細(xì)胞樣細(xì)胞之間相互轉(zhuǎn)化的證據(jù)之一。腫瘤微環(huán)境的改變可以引起腫瘤

4、干細(xì)胞的選擇性擴(kuò)增,其具體機(jī)制目前尚不明確,微環(huán)境中不同因素的改變所引起的腫瘤干細(xì)胞亞群是否相同也尚不清楚。大量研究表明放療、化療、無(wú)血清、缺氧和酸性條件等微環(huán)境因子的改變能引起腫瘤干細(xì)胞樣表型的變化或數(shù)量的增加。化療會(huì)導(dǎo)致腫瘤組織的急性損傷,微環(huán)境內(nèi)的促生長(zhǎng)信號(hào)可能會(huì)明顯的增加,用以促進(jìn)腫瘤組織的再生,隨之引起腫瘤干細(xì)胞池的明顯擴(kuò)大。研究表明體外化療后乳腺癌細(xì)胞群中干細(xì)胞比例較化療前明顯升高。但目前化療是否會(huì)引起乳腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞特性

5、的變化尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 為了初步檢驗(yàn)5Fu對(duì)MCF7細(xì)胞中干細(xì)胞樣細(xì)胞的影響,首先檢測(cè)了未分選的MCF7細(xì)胞系中的干細(xì)胞樣標(biāo)記(Oct4、Bmi—1、Sox2)在5Fu作用下表達(dá)的變化,然后分選MCF7細(xì)胞系中的干細(xì)胞樣細(xì)胞(CD44+／CD24-細(xì)胞),分別檢測(cè)在5Fu作用下干細(xì)胞樣細(xì)胞群和非干細(xì)胞樣細(xì)胞群中干細(xì)胞樣細(xì)胞的變化情況,但是因?yàn)榉诌x的細(xì)胞數(shù)量不足以提取RNA和細(xì)胞爬片,因此只應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了分選后細(xì)胞中C

6、D44+／CD24.細(xì)胞的比例。
　　 材料和方法:
　　 1、MCF-7細(xì)胞用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,于37℃、5％CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況換液、傳代和凍存。
　　 2、0.1μg／ml5Fu處理MCF7。RT-PCR法分別檢測(cè)人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中處理前G0及處理后6代細(xì)胞G1-G6中Oct4、Bmi-1和Sox2 mRNA的表達(dá)情況。
　　 3

7、、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)處理前G0及處理后G1-G5中Oct4的表達(dá)。
　　 4、流式細(xì)胞儀分選CD44+CD24-細(xì)胞。細(xì)胞分組:經(jīng)過(guò)FITC-CD44／PE-CD24抗體標(biāo)記,將MCF7細(xì)胞分成兩群:CD44+CD24-細(xì)胞群,即干細(xì)胞樣細(xì)胞群,另一群為非干細(xì)胞樣細(xì)胞群。分選的細(xì)胞接種到六孔板中繼續(xù)培養(yǎng),每組三個(gè)復(fù)孔。①干細(xì)胞樣細(xì)胞群常規(guī)培養(yǎng)組；②干細(xì)胞樣細(xì)胞5FU(0.1μg／ml)組；③非干細(xì)胞樣細(xì)胞群常規(guī)培養(yǎng)組；④非干細(xì)胞樣

8、細(xì)胞5FU(0.1μg／ml)組。
　　 5、流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞在不同培養(yǎng)時(shí)間(0h、24h、48h、72h、144h、168h)的CD44+CD24-細(xì)胞的比例。
　　 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)中,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,結(jié)果應(yīng)用單因素方差分析和配對(duì)資料t檢驗(yàn)(t-test)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1、RT-P

9、CR的結(jié)果:5Fu處理后第三代G3和第五代G5中Oct4mRNA的表達(dá)較處理前G0代明顯增高,G1、G2、G4、G6代中較處理前降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Bmi-1mRNA在處理后第三代G3和第五代G5中的表達(dá)較處理前G0代的表達(dá)明顯增高,G1、G4、G6代中Bmi-1的表達(dá)較處理前降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而第二代G2中的表達(dá)與處理前G0代的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Sox2mRNA在處理后第三代G3和第五代G5中的表達(dá)較處理前G0代的表達(dá)

10、明顯增高,G2、G4、G6代中Sox2的表達(dá)較處理前降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而第一代G1中的表達(dá)與處理前G0代的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2、免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果:在MCF7細(xì)胞系中,Oct4主要在細(xì)胞核表達(dá),細(xì)胞漿也有表達(dá)。Oct4在G1-G5代中蛋白的表達(dá)與處理前G0代的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與G0代相比,Oct4的表達(dá)表現(xiàn)出降低-升高-更高-降低-升高的趨勢(shì)。
　　 3、MCF7細(xì)胞系中CD44+CD24-細(xì)胞的

11、比例為24.75％±1.20,但為了進(jìn)一步保證CD44+CD24-細(xì)胞的分選純度,實(shí)際分選的MCF7細(xì)胞系中CD44+CD24-細(xì)胞的比例為15.35％±0.35。干細(xì)胞群組(CD44+CD24-細(xì)胞組)體積較小,倒置顯微鏡下也見(jiàn)干細(xì)胞群組細(xì)胞體積更小,更接近圓形。
　　 4、干細(xì)胞群組中,常規(guī)培養(yǎng)對(duì)照組細(xì)胞在0h、24h、48h、72h、144h、168h時(shí)CD44+／CD24-細(xì)胞的比例(％)呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。經(jīng)5FU處理

12、后,CD44+／CD24-細(xì)胞的比例增高。5FU組與常規(guī)培養(yǎng)對(duì)照組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。非干細(xì)胞群組中,常規(guī)培養(yǎng)對(duì)照組細(xì)胞在0h、24h、48h、72h、144h、168h時(shí)CD44+／CD24.細(xì)胞的比例(％)呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)。經(jīng)5FU處理后,CD44+／CD24-細(xì)胞的比例增高。5FU組與常規(guī)培養(yǎng)對(duì)照組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1、MCF7細(xì)胞中Oct4、Bmi-1、Sox2的mRNA及Oct