5-Fu對人肝癌PLC-RAF-5細胞株中干細胞樣細胞富集作用的研究.pdf

1、[背景]
　　原發(fā)性肝癌(Primarylivercancer,PLC)是世界上第五大惡性腫瘤,近年來其發(fā)病率有逐年增加的趨勢[1]。肝細胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)是原發(fā)性肝癌的主要類型,占90％以上。HCC的主要治療手段仍然是為手術(shù)治療,然而術(shù)后復發(fā)率高達80%,即使小肝癌也高達43.5%,5年無瘤生存率僅為10%-30%[2]。肝癌細胞大多對放、化療的不敏感,是影響肝癌整體療效的重要因素。對

2、肝癌術(shù)后易于復發(fā)及對放化療耐受的細胞和分子生物學機制的研究,一直沒有很大的突破,也始終是肝癌研究的難點與熱點。
　　近年來,隨著腫瘤干細胞(CancerStemCell,CSC)學說的提出,為肝癌高復發(fā)率及對放化療耐受的分子細胞學機制提供了新的研究思路。CSC學說認為,腫瘤細胞是由大量的有限增殖成熟細胞和一小部分無限增殖的干細胞組成的,雖然前者可被手術(shù)切除或放化療所殺滅,但只要剩下極小部分CSC,仍然可形成新的腫瘤組織。因此,CS

3、C是腫瘤術(shù)后轉(zhuǎn)移、復發(fā)和對放化療耐受的基礎(chǔ)。
　　對肝癌干細胞的研究進展,國內(nèi)外目前處于起始階段,如何篩選分離出肝癌CSC,并進行特征鑒定,是目前的難點。利用細胞表面標記物篩選法和無血清懸浮培養(yǎng)+側(cè)群細胞篩選法是目前獲取肝癌CSC的主要,但均都存在或多或少的缺陷。本研究利用肝癌對化療耐藥的特性,采用5-Fu富集肝癌CSC,并進一步分離和鑒定,探討肝癌CSC的篩選方法及其生物學特性。
　　[目標]
　　1建立富集肝癌干細

4、胞的方法,解決肝癌干細胞研究中因癌干細胞數(shù)量少所致的瓶頸問題。
　　2低劑量5-Fu反復作用肝癌細胞株后,研究殘余細胞干細胞樣生物學特性。
　　[方法]
　　圍繞上述目標,本研究主要研究方法如下:
　　1對低劑量5-Fu相對耐藥的肝癌PLC/RAF/5/5-Fu細胞株誘導獲得
　　采用低濃度的5-Fu(1ug/mL)反復作用于肝癌PLC/RAF/5細胞株,當細胞能在含1ug/mL5-Fu的培養(yǎng)液中存活時,即

5、為人肝癌PLC/RAF/5/5-Fu細胞株;顯微鏡下觀察兩種細胞形態(tài)學;用CCK-8檢測兩種細胞對5-Fu的耐藥性。
　　2肝癌細胞株P(guān)LC/RAF/5、PLC/RAF/5/5-Fu的體外實驗
　　細胞周期的檢測;細胞凋亡檢測;Transwell細胞遷移實驗及細胞劃痕實驗檢測遷移能力;平板克隆集落實驗檢測增殖能力;WesternBlot檢測Bax、Bcl-2、FoxM1、ABCG2蛋白。
　　3側(cè)群細胞的檢測
　

6、　分別檢測SP細胞在PLC/RAF/5/5-Fu細胞株與PLC/RAF/5細胞株中的含量。
　　[結(jié)果]
　　11ug/mL低濃度5-Fu反復作用于PLC/RAF/5細胞株后,得到的PLC/RAF/5/5-Fu細胞株形態(tài)發(fā)生改變,與親本細胞相比,PLC/RAF/5/5-Fu細胞棱角減少,呈長梭形樣改變,胞漿清亮、折光性增強,細胞呈片狀生長,細胞傳代時的消化時間明顯縮短,不易吹打成單細胞懸液,且單個細胞的形態(tài)多不規(guī)則,和親本細

7、胞株之間存在顯著差異;且CCK8實驗表明:PLC/RAF/5/5-Fu細胞對5-Fu的相對抑制率低于親本細胞,表明PLC/RAF/5/5-Fu對低濃度的5-Fu具有一定的耐藥性。
　　2PLC/RAF/5/5-Fu細胞和PLC/RAF/5細胞相比:
　　2.1PLC/RAF/5細胞細胞周期G0/G1期細胞分布比率低于親本細胞株,而S期和G2/M期細胞分布比率明顯高于親本細胞株,差異具有統(tǒng)計學意義(n=3,p<0.05)。

8、r>　　2.2在0.5ug/ml、1ug/ml、2ug/ml的5-Fu作用下,PLC/RAF/5和PLC/RAF/5/5-Fu細胞AnnexinV+細胞比列分別為:(4±1.25)%、(11.24±2.64)%、(27.48±2.16)%和(3.21±0.65)%、(3.6±0.83)%、(5.42±1.2)%,表明PLC/RAF/5/5-Fu細胞抗凋亡能力強。
　　2.3細胞劃痕實驗及Transwell細胞遷移實驗表明:PLC/

9、RAF/5/5-Fu細胞比PLC/RAF/5細胞遷移能力強。
　　2.4平板克隆集落實驗提示:與PLC/RAF/5細胞相比,PLC/RAF/5/5-Fu細胞形成的克隆較密集且直徑較大,其CFA為(26.01±3.42)%,而PLC/RAF/5/5-Fu細胞的CFA為(35.83±4.51)%,二者有統(tǒng)計學意義(N=3,P<0.05)。
　　2.5Westernblot表明PLC/RAF/5/5-Fu細胞的Bax、Bcl-2、

10、ABCG2和FoxM1蛋白的表達量明顯增加。
　　以上結(jié)果均表明PLC/RAF/5/5-Fu細胞的生物學特性與CSCs相似。
　　3PLC/RAF/5細胞中SP細胞比例顯著高于用Verapamil阻斷后的對照組(3.3±1.2)%vs(0.0±0.0)%,P<0.01;PLC/RAF/5/5-Fu細胞中SP細胞的比例亦顯著高于對照組(22.6±1.8)%vs(4.1±1.6)%,P<0.01,表明5-Fu篩選可以富集SP細胞