5-Fu對(duì)人肝癌PLC-RAF-5細(xì)胞株中干細(xì)胞樣細(xì)胞富集作用的研究.pdf

1、[背景]
　　原發(fā)性肝癌(Primarylivercancer,PLC)是世界上第五大惡性腫瘤,近年來其發(fā)病率有逐年增加的趨勢(shì)[1]。肝細(xì)胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)是原發(fā)性肝癌的主要類型,占90％以上。HCC的主要治療手段仍然是為手術(shù)治療,然而術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)80%,即使小肝癌也高達(dá)43.5%,5年無瘤生存率僅為10%-30%[2]。肝癌細(xì)胞大多對(duì)放、化療的不敏感,是影響肝癌整體療效的重要因素。對(duì)

2、肝癌術(shù)后易于復(fù)發(fā)及對(duì)放化療耐受的細(xì)胞和分子生物學(xué)機(jī)制的研究,一直沒有很大的突破,也始終是肝癌研究的難點(diǎn)與熱點(diǎn)。
　　近年來,隨著腫瘤干細(xì)胞(CancerStemCell,CSC)學(xué)說的提出,為肝癌高復(fù)發(fā)率及對(duì)放化療耐受的分子細(xì)胞學(xué)機(jī)制提供了新的研究思路。CSC學(xué)說認(rèn)為,腫瘤細(xì)胞是由大量的有限增殖成熟細(xì)胞和一小部分無限增殖的干細(xì)胞組成的,雖然前者可被手術(shù)切除或放化療所殺滅,但只要剩下極小部分CSC,仍然可形成新的腫瘤組織。因此,CS

3、C是腫瘤術(shù)后轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和對(duì)放化療耐受的基礎(chǔ)。
　　對(duì)肝癌干細(xì)胞的研究進(jìn)展,國內(nèi)外目前處于起始階段,如何篩選分離出肝癌CSC,并進(jìn)行特征鑒定,是目前的難點(diǎn)。利用細(xì)胞表面標(biāo)記物篩選法和無血清懸浮培養(yǎng)+側(cè)群細(xì)胞篩選法是目前獲取肝癌CSC的主要,但均都存在或多或少的缺陷。本研究利用肝癌對(duì)化療耐藥的特性,采用5-Fu富集肝癌CSC,并進(jìn)一步分離和鑒定,探討肝癌CSC的篩選方法及其生物學(xué)特性。
　　[目標(biāo)]
　　1建立富集肝癌干細(xì)

4、胞的方法,解決肝癌干細(xì)胞研究中因癌干細(xì)胞數(shù)量少所致的瓶頸問題。
　　2低劑量5-Fu反復(fù)作用肝癌細(xì)胞株后,研究殘余細(xì)胞干細(xì)胞樣生物學(xué)特性。
　　[方法]
　　圍繞上述目標(biāo),本研究主要研究方法如下:
　　1對(duì)低劑量5-Fu相對(duì)耐藥的肝癌PLC/RAF/5/5-Fu細(xì)胞株誘導(dǎo)獲得
　　采用低濃度的5-Fu(1ug/mL)反復(fù)作用于肝癌PLC/RAF/5細(xì)胞株,當(dāng)細(xì)胞能在含1ug/mL5-Fu的培養(yǎng)液中存活時(shí),即

5、為人肝癌PLC/RAF/5/5-Fu細(xì)胞株;顯微鏡下觀察兩種細(xì)胞形態(tài)學(xué);用CCK-8檢測兩種細(xì)胞對(duì)5-Fu的耐藥性。
　　2肝癌細(xì)胞株P(guān)LC/RAF/5、PLC/RAF/5/5-Fu的體外實(shí)驗(yàn)
　　細(xì)胞周期的檢測;細(xì)胞凋亡檢測;Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測遷移能力;平板克隆集落實(shí)驗(yàn)檢測增殖能力;WesternBlot檢測Bax、Bcl-2、FoxM1、ABCG2蛋白。
　　3側(cè)群細(xì)胞的檢測
　

6、　分別檢測SP細(xì)胞在PLC/RAF/5/5-Fu細(xì)胞株與PLC/RAF/5細(xì)胞株中的含量。
　　[結(jié)果]
　　11ug/mL低濃度5-Fu反復(fù)作用于PLC/RAF/5細(xì)胞株后,得到的PLC/RAF/5/5-Fu細(xì)胞株形態(tài)發(fā)生改變,與親本細(xì)胞相比,PLC/RAF/5/5-Fu細(xì)胞棱角減少,呈長梭形樣改變,胞漿清亮、折光性增強(qiáng),細(xì)胞呈片狀生長,細(xì)胞傳代時(shí)的消化時(shí)間明顯縮短,不易吹打成單細(xì)胞懸液,且單個(gè)細(xì)胞的形態(tài)多不規(guī)則,和親本細(xì)

7、胞株之間存在顯著差異;且CCK8實(shí)驗(yàn)表明:PLC/RAF/5/5-Fu細(xì)胞對(duì)5-Fu的相對(duì)抑制率低于親本細(xì)胞,表明PLC/RAF/5/5-Fu對(duì)低濃度的5-Fu具有一定的耐藥性。
　　2PLC/RAF/5/5-Fu細(xì)胞和PLC/RAF/5細(xì)胞相比:
　　2.1PLC/RAF/5細(xì)胞細(xì)胞周期G0/G1期細(xì)胞分布比率低于親本細(xì)胞株,而S期和G2/M期細(xì)胞分布比率明顯高于親本細(xì)胞株,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=3,p<0.05)。

8、r>　　2.2在0.5ug/ml、1ug/ml、2ug/ml的5-Fu作用下,PLC/RAF/5和PLC/RAF/5/5-Fu細(xì)胞AnnexinV+細(xì)胞比列分別為:(4±1.25)%、(11.24±2.64)%、(27.48±2.16)%和(3.21±0.65)%、(3.6±0.83)%、(5.42±1.2)%,表明PLC/RAF/5/5-Fu細(xì)胞抗凋亡能力強(qiáng)。
　　2.3細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)表明:PLC/

9、RAF/5/5-Fu細(xì)胞比PLC/RAF/5細(xì)胞遷移能力強(qiáng)。
　　2.4平板克隆集落實(shí)驗(yàn)提示:與PLC/RAF/5細(xì)胞相比,PLC/RAF/5/5-Fu細(xì)胞形成的克隆較密集且直徑較大,其CFA為(26.01±3.42)%,而PLC/RAF/5/5-Fu細(xì)胞的CFA為(35.83±4.51)%,二者有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(N=3,P<0.05)。
　　2.5Westernblot表明PLC/RAF/5/5-Fu細(xì)胞的Bax、Bcl-2、

10、ABCG2和FoxM1蛋白的表達(dá)量明顯增加。
　　以上結(jié)果均表明PLC/RAF/5/5-Fu細(xì)胞的生物學(xué)特性與CSCs相似。
　　3PLC/RAF/5細(xì)胞中SP細(xì)胞比例顯著高于用Verapamil阻斷后的對(duì)照組(3.3±1.2)%vs(0.0±0.0)%,P<0.01;PLC/RAF/5/5-Fu細(xì)胞中SP細(xì)胞的比例亦顯著高于對(duì)照組(22.6±1.8)%vs(4.1±1.6)%,P<0.01,表明5-Fu篩選可以富集SP細(xì)胞