乳腺癌患者腋窩前哨淋巴結(jié)CK19、MG的PCR檢測(cè)——腋窩分期的快速輔助診斷方法及其價(jià)值研究.pdf

1、研究背景：
　　 乳腺癌患者腋窩淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況，直接影響著乳腺癌患者的10年復(fù)發(fā)率及生存率，所以腋窩淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況是一個(gè)重要的預(yù)后判斷指1。而前哨淋巴結(jié)(sentinel lymph node)，作為第一個(gè)接收原發(fā)乳腺癌區(qū)域淋巴引流的淋巴結(jié)2，其狀態(tài)可以準(zhǔn)確反映腋窩淋巴結(jié)是否出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移3。
　　 前哨淋巴結(jié)活檢與腋窩淋巴結(jié)清掃對(duì)比，前哨淋巴結(jié)狀態(tài)可判斷腋窩分期。前哨淋巴結(jié)的病理檢查效能已經(jīng)提高，更多的淋巴結(jié)微小轉(zhuǎn)

2、移灶(MICmicrometastases＞0.2mm to2mm)及孤立腫瘤細(xì)胞(ITC Isolated Tumor Cell≤0.2mm)可以被檢出。Reed J等人4對(duì)進(jìn)行過(guò)前哨淋巴結(jié)活檢的的病人10年的回顧性研究中發(fā)現(xiàn)，MIC與病人的非前哨淋巴結(jié)陽(yáng)性和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是有相關(guān)性的，而ITC則沒(méi)有相關(guān)性。ITC在最新病理學(xué)分類中歸于淋巴結(jié)陰性，MIC則定義為淋巴結(jié)陽(yáng)性5。所以前哨淋巴結(jié)檢測(cè)為MIC的病人，需要積極的乳腺癌術(shù)后輔助治療4。

3、所以快速輔助珍斷淋巴結(jié)大于0.2mm的前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，可以幫助外科醫(yī)生判斷患者腋窩分期，從而決定手術(shù)方式，及后續(xù)輔助治療。
　　 我中心乳腺癌病的保乳包腋窩手術(shù)在國(guó)內(nèi)處于領(lǐng)先水平，有近50％的病人采用保乳手術(shù)及前哨淋巴結(jié)活檢進(jìn)行治療。在術(shù)中將腫物，腫物殘腔邊緣及SLN送術(shù)中冰凍活檢，根據(jù)腫物邊緣情況及SLN情況決定是否進(jìn)行乳腺痛改良根治術(shù)及腋窩淋巴結(jié)清掃術(shù)。SLN術(shù)中冰凍，一般取淋巴結(jié)最大徑切片，行HE染色鏡檢。Takei H等

4、7在隊(duì)列研究中發(fā)現(xiàn)，術(shù)中冰凍的假陰性率為11.7％。現(xiàn)有的冰凍切片技術(shù)，因?yàn)槊舾行缘?，在活檢過(guò)程中，往往可以導(dǎo)致50％的淋巴結(jié)組織丟8，術(shù)中冰凍出現(xiàn)假陰性，術(shù)后病理若為陽(yáng)性時(shí)，會(huì)導(dǎo)致二次手術(shù)以及醫(yī)療費(fèi)用增高，同時(shí)也增加了患者的精神壓力及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，我們需要一個(gè)更可靠的檢驗(yàn)方式，作為術(shù)中冰凍的輔助參考指標(biāo)，減小術(shù)中冰凍假陰性率，提高SLNB的陽(yáng)性檢出率，以減少二次手術(shù)率。
　　 隨著科學(xué)和技術(shù)的發(fā)展，采用對(duì)細(xì)胞特異的信使RNA

5、逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行擴(kuò)增的實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈技術(shù)(Q-RT-PCR)，我們可以提高腫瘤基因的檢測(cè)的敏感性。理想的乳腺腫瘤標(biāo)記物應(yīng)為特異性、敏感性高，同時(shí)為前哨淋巴結(jié)中并不表達(dá)的基因。
　　 該實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CK19及MG作為淋巴結(jié)陽(yáng)性的腫瘤標(biāo)汜物，以淋巴結(jié)的病理連續(xù)切片為金標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶＞0.2mm(MIC)的敏感性和特異性，及其陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值。PBGD(Porphobilinogendeaminase，膽色素原脫氨酶)作

6、為前哨淋巴結(jié)的看家基因，選為該試驗(yàn)的內(nèi)部質(zhì)控。
　　 研究目的：
　　 本試驗(yàn)的主要目的是評(píng)價(jià)CK19和MG的PCR檢測(cè)，在判斷乳腺癌患者腋窩前哨淋巴結(jié)狀態(tài)的敏感性和特異性。
　　 本試驗(yàn)的次要目的是評(píng)CK19和MG用于乳腺癌患者腋窩前哨淋巴結(jié)狀態(tài)檢測(cè)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值。
　　 材料與方法：
　　 一、樣本資料
　　 入組條件：1、確珍乳癌病人并計(jì)劃手術(shù)進(jìn)行SLNB者；2、年齡≥18

7、歲，男性或女性；3、簽署臨床實(shí)驗(yàn)知情同意書者(OCD-200804)
　　 排出條件：1、患者已參加其他臨床實(shí)驗(yàn)研究；2、同側(cè)已進(jìn)行過(guò)前哨淋巴結(jié)活檢術(shù)；3、不符合邏輯病例：例如手術(shù)時(shí)間到淋巴結(jié)勻漿時(shí)間大于45分鐘。
　　 本實(shí)驗(yàn)全部入組病人67例，排除13例，其中包括良性疾病3例，不符合邏輯病例10例。54例乳腺癌病例臨床資料數(shù)據(jù)如下：
　　 1、手術(shù)情況：54例病人保乳根治術(shù)36例，改良根治術(shù)17例，其他1例。

8、
　　 2、根據(jù)腫瘤分期：Stage08例，StageⅠ15例，StageⅡ22例，StageⅢ3例，外院切取活檢3例，未知3例。
　　 3、根據(jù)腫瘤病理：浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌37例，浸潤(rùn)性小葉癌2例，原位癌8例，粘液癌2例，Paget's?、窭?，髓樣癌1例，囊內(nèi)乳頭狀癌1例，腺樣囊狀癌1例，實(shí)性神經(jīng)內(nèi)分泌癌1例。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、實(shí)驗(yàn)試劑：GeneSearch TM BLN Test Kit，由兩

9、部分試劑盒組成，分別為淋巴結(jié)準(zhǔn)備試劑盒(GeneSearch TM RNA Samp1e Preparation Kit)和乳腺癌淋巴結(jié)試劑盒(GeneSearch TM BLN Kit)
　　 2、取材方法：取患者藍(lán)染前哨淋巴結(jié)送病理室，將淋巴結(jié)按要求切成偶數(shù)塊，將奇數(shù)塊送Q-RT-PCR檢驗(yàn)，偶數(shù)塊送病理組織學(xué)檢驗(yàn)。
　　 3、對(duì)CK19及MG進(jìn)行實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使用CepheidSmartCyc1er(R

10、)系統(tǒng)產(chǎn)生目標(biāo)基因的表達(dá)數(shù)據(jù)。然后根據(jù)預(yù)先確定的標(biāo)準(zhǔn)，提供定性結(jié)果。可快速檢測(cè)前哨淋巴結(jié)大于0.2mm的轉(zhuǎn)移灶。
　　 4、以病理學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)比淋巴結(jié)Q-RT-PCR結(jié)果，評(píng)價(jià)CK19及MG作為乳腺癌患者腋窩前哨淋巴結(jié)狀態(tài)快速輔助檢測(cè)指標(biāo)的敏感性和特異性，以及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值。
　　 三、病理診斷標(biāo)準(zhǔn)：
　　 病理學(xué)診斷為金標(biāo)準(zhǔn)。病理學(xué)陽(yáng)性是指前哨淋巴結(jié)的病理切片中癌轉(zhuǎn)移灶＞0.2mm
　　

11、 四、統(tǒng)計(jì)方法
　　 1、采用以下標(biāo)準(zhǔn)公式計(jì)算CK19和MG的敏感性和特異性：敏感性=(真陽(yáng)性/(真陽(yáng)性+假陰性))*100％特異性=(真陰性/(真陰性+假陽(yáng)性))*100％
　　 2、采用以下標(biāo)準(zhǔn)公式計(jì)算CK19和MG的陽(yáng)性預(yù)測(cè)價(jià)值和陰性預(yù)測(cè)價(jià)值：陽(yáng)性預(yù)測(cè)價(jià)值=真陽(yáng)性/(真陽(yáng)性+假陽(yáng)性)*100％陰性預(yù)測(cè)價(jià)值=真陰旺/(真陰性+假陰性)*100％
　　 3、靈敏性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)價(jià)值和陰性預(yù)測(cè)價(jià)值的95％胃

12、信區(qū)間的估計(jì)將根據(jù)二項(xiàng)分布進(jìn)行計(jì)算。95％CI p-1.96(p(1-p)/n)-2 p+1.96(p(1-p)/n)-2
　　 結(jié)果：
　　 1 CK19及MG作為腫瘤標(biāo)記物行PCR擴(kuò)增，與病理金標(biāo)準(zhǔn)比較：敏感度：90.91％95％CI：[0.90,0.92]特異性：94.03％95％CI：[0.93,0.95]陽(yáng)性預(yù)測(cè)價(jià)值71.43％95％CI[0.69,0.73]陰性預(yù)測(cè)價(jià)值98.44％95％CI：[0.98,0.

13、99]卡方檢驗(yàn)：P=0.375＞0.05 PCR及連續(xù)病理切片無(wú)明顯差異
　　 2本中心病理及冰凍病理結(jié)果一致。符合率：96％ Kappa=1
　　 結(jié)論：
　　 CK19及MG作為腫瘤標(biāo)汜物行PCR擴(kuò)增，與病理金標(biāo)準(zhǔn)比較敏感性和特異性分別為90.91％和94.03％，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值是71.43％和98.44％。PCR擴(kuò)增CK19及MG可以成為病理檢查的一種快速輔助檢測(cè)手段，與病理結(jié)果相比，假陽(yáng)性率高。是