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1、目的:觀察Neuritin過表達(dá)對Neuralized和Neuralized介導(dǎo)的Notch信號通路的影響,明確Neuritin與Neuralized介導(dǎo)的Notch信號通路的關(guān)系,探討Neuritin在調(diào)控細(xì)胞命運,調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移,分化和增殖中的作用機制。 方法: (1)運剛免疫共沉淀技術(shù)(immunoprecipitation,IP)驗證Neuritin與Neuralized之間的相互作用 ①構(gòu)建pcDNA3.
2、1-his/myc-neuritin質(zhì)粒pcDNA3.1-flag-neuralized質(zhì)粒; ②利用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將上述真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞; ③采用免疫共沉淀技術(shù)(正向和反向)檢測上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Neuritin和Neuralized的相互作用。 (2)利用真核表達(dá)技術(shù),觀察Neuritin過表達(dá)對Neuralized介導(dǎo)的Notch信號通路的影響 ①構(gòu)建pEGFP-C1-JAG1-TB熒
3、光表達(dá)載體; ②利用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將pIRES-HA-Jag1或pEGFP-C1-JAG1-TB質(zhì)粒,bpcDNA3.1-flag-neuralized質(zhì)粒,pcDNA3.1-his-neuritin質(zhì)粒,分組轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞; ③用western-blot技術(shù)檢測三組細(xì)胞中Neuritin,Neuralized和JAG1的表達(dá)情況; ④利用細(xì)胞內(nèi)定位技術(shù)觀察三組細(xì)胞中Neuritin蛋白對JAG1-TB蛋白
4、內(nèi)吞的影響。 結(jié)果: (1)Neurtitin蛋白和Neuralized蛋白免疫共沉淀檢測結(jié)果顯示:細(xì)胞內(nèi)Neuritin蛋白可Neuralized蛋白發(fā)生相互作用; (2)利用western-blot技術(shù)檢測Neuritin蛋白對Neuralized介導(dǎo)的Notch配體蛋白JAG1表達(dá)水平的影響結(jié)果顯示:Neuritin蛋白能夠抑制Neuralized蛋白介導(dǎo)的JAG1蛋白表達(dá)下調(diào); (3)利用細(xì)胞內(nèi)定
5、位技術(shù)觀察三組細(xì)胞中Neuritin對Neuralized介導(dǎo)的JAG1內(nèi)吞的影響的實驗結(jié)果顯示:Neuritin蛋白可以部分的抑制JAG1蛋白的內(nèi)吞。 結(jié)論: (1)Neuritin蛋白能夠與Neuralized蛋白相互作用; (2)Neuritin蛋白能夠抑制Neuralized蛋白介導(dǎo)的JAG1蛋白表達(dá)下調(diào); (3)Neuritin蛋白能夠部分抑制Neuralized蛋白介導(dǎo)的JAG1-TB蛋白內(nèi)吞
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