下調(diào)miR-221-222在人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移能力.pdf

1、目的:
　　為了探討microRNAs(miRNAs)在人類乳腺癌中的調(diào)控作用，本研究利用反義DNA技術(shù)敲低miR-221/222的表達(dá)從而調(diào)節(jié)其靶基因組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMP3），以便研究其對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞系的增殖和遷移能力的影響以及其分子生物學(xué)作用機(jī)制，為乳腺癌的進(jìn)一步臨床治療研究提供一些新的基礎(chǔ)理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.構(gòu)建低表達(dá)miR-221/222的穩(wěn)定細(xì)胞株
　　依據(jù)miRBase

2、數(shù)據(jù)庫(kù)中hsa-miR-221、hsa-miR-222的寡核苷酸序列和一段無義序列，分別設(shè)計(jì)并重組成質(zhì)粒AS-miR-221（antisense-miR-221即反義抑制miR-221）、AS-miR-222(antisense-miR-222即反義抑制miR-222)和Scramble（無義抑制），并將其分別使用脂質(zhì)體（LipofectamineTM2000）轉(zhuǎn)染人乳腺癌MCF-7細(xì)胞，然后經(jīng)過G418抗性篩選后建立穩(wěn)定表達(dá)的對(duì)照組（

3、Ctrl.、Scramble）細(xì)胞株、低表達(dá)miR-221和/或miR-222組(即AS-miR-221、AS-miR-222和AS-miR-221/222)細(xì)胞株。
　　轉(zhuǎn)染后于熒光顯微鏡下檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率;逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)各組穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株中質(zhì)粒載體上攜帶的抗性neo基因的表達(dá)情況，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染是否成功;Westernblot檢測(cè)各組穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株中靶蛋白TIMP3的表達(dá)情況，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染是否整合。
　　2.在穩(wěn)定低表達(dá)細(xì)胞模型的基

4、礎(chǔ)上進(jìn)行機(jī)制研究
　　進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR、Real-time PCR、Western blot等檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中miR-221、miR-222、TIMP3 mRNA和ADAM17的表達(dá)差異。
　　3.在穩(wěn)定低表達(dá)細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)
　　采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)并繪制生長(zhǎng)曲線觀察低表達(dá)miR-221和miR-222組細(xì)胞的生長(zhǎng)能力;劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的遷移能力。
　　結(jié)果:
　　轉(zhuǎn)染24小時(shí)之后

5、，在熒光顯微鏡下觀察到各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的綠色熒光蛋白表達(dá)較多，即轉(zhuǎn)染效率較高;轉(zhuǎn)染后檢測(cè)各組細(xì)胞株中neo基因和靶蛋白TIMP3的表達(dá):與對(duì)照組比較，neo基因和TIMP3蛋白表達(dá)明顯升高，即證實(shí)反義抑制的低表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建成功。與Scramble組細(xì)胞表達(dá)情況相比較，各低表達(dá)miR-221/222(AS-miR-221、AS-miR-222、AS-miR-221/222)組細(xì)胞株中miR-221、miR-222的表達(dá)量降低，進(jìn)一步說明質(zhì)

6、粒構(gòu)建成功且發(fā)揮了抑制miRNAs表達(dá)的功效;TIMP3 mRNA水平的表達(dá)是升高的，而其調(diào)控的金屬蛋白酶(ADAM17)的水平是降低的;生長(zhǎng)曲線顯示各低表達(dá)miR-221/222組細(xì)胞的生長(zhǎng)能力明顯受到抑制，劃痕結(jié)果顯示各低表達(dá)miR-221/222組細(xì)胞的遷移能力是降低的。
　　結(jié)論:
　　本研究成功構(gòu)建了低表達(dá)miR-221/222的穩(wěn)定細(xì)胞株;并利用功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)，敲低miR-221/222后可以通過上調(diào)TIMP3表達(dá)