南蛇藤有效部位對SGC-7901、Hela細(xì)胞增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。凋亡是多基因嚴(yán)格控制的過程，這些基因在種屬之間非常嚴(yán)密，如Bc1-2家族、caspase家族、抑癌基因P53、癌基因C-myc等。從細(xì)胞凋亡這一新視角來看中醫(yī)藥抗腫瘤作用，對于從分子水平揭示中藥的作用機(jī)制，篩選新的抗癌中藥具有十分重要的意義。 南蛇藤(Celastrus orbiculatus)為衛(wèi)矛科南蛇藤(celastrus)屬植物，分布廣泛，其藤莖、根、葉、果

2、均可入藥?，F(xiàn)代藥物化學(xué)研究證實(shí)南蛇藤某些成分(如倍半萜烯酯類)具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。在現(xiàn)階段，國內(nèi)外對南蛇藤的系統(tǒng)抗癌活性及機(jī)理研究均無相關(guān)報(bào)道。本課題是從體外對南蛇藤有效部位抑制腫瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡作用的相關(guān)研究，為南蛇藤的進(jìn)一步研究開拓思路。 1．目的： 研究南蛇藤乙酸乙酯、正丁醇提取物體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖，確定南蛇藤有效部位具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，初步揭示其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的途徑，為南蛇藤應(yīng)用于開發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。

3、 2．方法： 2.1 MTT法采用四氮唑鹽(MTT)還原法測定南蛇藤乙酸乙酯、正丁醇提取物的體外抑瘤率。以同一提取部位的不同濃度對人胃癌SGC-7901細(xì)胞、人子宮頸癌細(xì)胞-Hela抑制率作圖得到劑量-效應(yīng)圖譜。 2.2 雙熒光標(biāo)記法-A0/EB采用吖啶橙(A0)/溴化乙啶(EB)雙熒光染色及熒光顯微鏡觀察經(jīng)南蛇藤乙酸乙酯、正丁醇提取物作用后的人胃癌SGC-901細(xì)胞、人子宮頸癌細(xì)胞-Hela中凋亡細(xì)胞形態(tài)。 2

4、.3 FITC-Annexin V與PI雙染色法采用流式細(xì)胞術(shù)檢測南蛇藤乙酸乙酯、正丁醇提取物作用于人胃癌SGC-7901細(xì)胞、人子宮頸癌細(xì)胞-Hela后的凋亡細(xì)胞數(shù)。 2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測抑癌基因-P53蛋白采用流式細(xì)胞術(shù)，通過間接熒光標(biāo)記法測定SGC-7901細(xì)胞、Hela細(xì)胞中P53蛋白變化。P53蛋白熒光指數(shù)(Fluoresence Index，F(xiàn)I)表示定量的P53蛋白。綠熒光LOG收集的熒光強(qiáng)度峰值數(shù)轉(zhuǎn)化成線性刻度

5、，對照管作為陰性表達(dá)FI=1。FI計(jì)算公式如下：FI=檢測管細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度/對照管細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度。如FI>1.0為陽性表達(dá)，F(xiàn)I≤1.0為陰性表達(dá)。 2.5 細(xì)胞免疫組化采用細(xì)胞免疫組化S-P染色法檢測人胃癌SGC-7901細(xì)胞、人子宮頸癌細(xì)胞中P53蛋白陽性表達(dá)率。 3．結(jié)果： 3.1 4個(gè)濃度的南蛇藤乙酸乙酯、正丁醇提取物(15、30、60、120μg/ml)對SGC-7901、Hela細(xì)胞均有一定的抑制

6、作用，且呈劑量依賴性。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異均有顯著性(P<0.01)。 3.2 SGC-7901、Hela細(xì)胞經(jīng)南蛇藤乙酸乙酯、正丁醇提取物作用后，根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)圖譜，F(xiàn)ITC+/PI-為凋亡細(xì)胞。不同濃度的南蛇藤提取物作用24h后，凋亡細(xì)胞比例明顯升高，且呈劑量依賴關(guān)系(P<0.01)。 3.3 利用流式細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測P53基因產(chǎn)物，隨著藥物濃度的增加，P53峰總體向右偏移。根據(jù)FI計(jì)算公式計(jì)算出FI值，經(jīng)南蛇藤乙酸

7、乙酯、正丁醇提取物作用24h后，P53均陽性表達(dá)，且FI值隨劑量的增加而增高。 3.4 熒光顯微鏡觀察到EB為紅色，只能染色死亡細(xì)胞核。正常活細(xì)胞胞膜完整，EB不能滲透，細(xì)胞核不能染色。A0為綠色，可用于染色活細(xì)胞。 對照組可見整個(gè)細(xì)胞為綠色，說明為正常活細(xì)胞。經(jīng)南蛇藤乙酸乙酯、正丁醇提取物作用后，整個(gè)細(xì)胞背景為綠色，細(xì)胞膜較完整，細(xì)胞核中紅色和綠色重合時(shí)為橘紅色，細(xì)胞核呈固縮狀或圓珠狀，即為細(xì)胞凋亡時(shí)的形態(tài)學(xué)改變(凋亡小體)。