SD大鼠舌背味蕾細胞分化的初步研究.pdf

1、本文研究內容及目的，擬進行以下實驗：利用BrdU標記舌背上皮細胞，研究其在舌背粘膜及味蕾的動態(tài)分布，揭示味蕾細胞遷移特點及味蕾外周上皮在味蕾細胞更新中的作用，為味蕾細胞分化研究奠定基礎。建立舌背上皮細胞分離、培養(yǎng)方法。在此基礎上，將舌背上皮細胞與神經元細胞共培養(yǎng)，期望舌背上皮細胞與神經元細胞建立連接關系，模擬體內神經支配情況，觀察在此培養(yǎng)體系中兩種細胞生長特性，并檢測舌背上皮細胞CK8的表達情況，探討舌背上皮細胞轉分化形成味蕾細胞的可行

2、性 第一部分：BrdU標記SD大鼠舌背上皮細胞的實驗研究。 研究材料與方法：36只2周齡的Sprague-Dawley(SD)大鼠，隨機分為空白對照組(8只)和實驗組(28只)；空白對照組內注射生理鹽水，實驗組腹腔內注射BrdU(3mg/kg)，分別于給藥后2h、1d、3d、5d、8d、11d、14d過量注射戍巴比妥處死3只實驗組及1只空白對照組動物；給藥后8h，處死7只實驗組及1只空白對照組動物。切取舌體前份1/3，浸

3、泡入10％的中性福爾馬林溶液，固定24小時以上，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，BrdU單抗免疫組織化學檢測。 研究結果 2.1舌背黏膜的BrdU陽性細胞舌背粘膜都能發(fā)現BrdU陽性細胞，開始時位于上皮的基底細胞層，隨時間推移，棘層、顆粒層、角化層上皮內逐漸出現BrdU陽性細胞。在給藥1周后，上皮內BrdU陽性細胞明顯減少；兩周后，上皮基本上己檢測不到陽性細胞，只在基底層內偶有散在的陽性細胞。 2.2味蕾內BrdU陽性

4、細胞隨時間推移，味蕾內BrdU陽性細胞逐漸增多，并從味蕾外周向中間遷移。 2.3味蕾與外周上皮的關系在給藥8h后，味蕾外周上皮細胞(STBEC)的BrdU陽性率較味蕾內高，差異有顯著性(P＜0.05)。周邊的味蕾細胞呈BrdU陽性者，其鄰近的STBEC有較高的陽性率(75％)，提示周邊的味蕾細胞可能由STBEC增殖分化形成。 研究結論：味蕾由處于各種不同分化階段的味蕾細胞組成；味蕾細胞可能來源于味蕾外周的舌背粘膜基底層細

5、胞。 第二部分：舌背上皮細胞與神經元細胞共培養(yǎng)及CK8表達檢測。 研究材料與方法： 1.1舌背上皮細胞的培養(yǎng)及鑒定斷頸處死出生后1天的SD大鼠，70％乙醇浸泡3-5min，切取舌體及下頜。D-Hank's沖洗血跡，2.5g/L洗必泰浸泡5-8分鐘，雙倍濃度的雙抗及兩性霉素沖洗3-4次。置入盛有平衡液的三角燒杯內，于粘膜下注射膠原酶(1mg/ml)，直至舌體發(fā)生腫脹，粘膜變白。37℃恒溫水浴箱內，膠原酶(0.2mg

6、/ml)消化1h。剝離舌背粘膜，刮除粘膜下層殘留的上皮細胞并收集。制備細胞懸液并以濃度為1x105/ml接種于培養(yǎng)瓶，移入37℃、含5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2天換液1次。倒置顯微鏡下觀察各代細胞形態(tài)、生長和增殖情況。當細胞鋪滿整個培養(yǎng)瓶底70％時，進行細胞傳代。采用細胞免疫化學染色法及透射電鏡觀察法對上皮細胞鑒定。 1.2神經元細胞的培養(yǎng)及鑒定斷頸處死新生1天的SD大鼠，無菌條件下取大腦皮質，置入Kreb's解剖液，解剖顯微

7、鏡下剝除腦膜后剪成0.5mm3小塊，平衡液洗滌3次，收集組織塊，胰酶消化，制備細胞懸液并以濃度為2.5×105/ml接種于L-多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)底，移入37℃、含5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長狀態(tài)，每隔2天換液1次。采用細胞免疫化學染色法對細胞進行鑒定。 1.3舌背上皮細胞與神經元細胞共培養(yǎng)將制備好的神經元細胞懸液5x105/ml與上皮細胞懸液2x105/ml混均(V∶V為1∶1)，接種于培養(yǎng)瓶接種于L

8、-多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶底，置于37℃、含5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長狀態(tài)，每隔2天換液1次。 1.4舌背上皮細胞CK8表達檢測采用細胞免疫化學法對共培養(yǎng)的上皮細胞CK8表達情況進行檢測。 研究結果： 2.1舌背上皮細胞的培養(yǎng)接種時，原代細胞形狀大小不等，呈多樣性，表現為多角狀扁平細胞、體積較大的球形細胞和體積較小的球形細胞。大多數細胞在培養(yǎng)24小時后貼壁；在培養(yǎng)3天后，細胞增殖形成許多

9、小而不規(guī)則的細胞克隆或集落，開始進入指數增殖階段，形成細胞團塊。隨著時間推移，細胞團塊周圍結構疏松，間隙增大，細胞團塊不斷增大，融合、連接成片，排列成鋪路石狀，可傳3-4代。 2.2神經元細胞的培養(yǎng)神經元細胞與上皮細胞共培養(yǎng)1天后，神經元細胞大部分貼壁，胞體飽滿，多呈紡錘狀，胞質透亮，胞體內伸出小突起，生長狀態(tài)良好，部分神經元細胞聚集成簇。培養(yǎng)5天后，神經元細胞的胞體增大，呈圓形或橢圓形，胞體周圍的突起充分伸展并延長，形成單級或

10、多極突起，軸突間相互交聯，形成網狀結構。培養(yǎng)10天后，大部分神經元細胞已裂解。 2.3舌背上皮細胞與神經元細胞共培養(yǎng)共培養(yǎng)早期，其生長特性與單獨培養(yǎng)相類似。培養(yǎng)5天后，上皮細胞增殖形成細胞群落，神經元細胞部分死亡。鏡下可見上皮細胞中心或周圍者存在神經元細胞。 2.4舌背上皮細胞CK8表達情況CK8細胞免疫化學法檢測發(fā)現，在本實驗條件下，舌背上皮細胞呈CK8陰性表達。 研究結論： 3.1以DMEM/F12為