腦脊液介導的間充質干細胞治療神經變性疾病的試驗研究.pdf

1、目的：(1)探索神經變性疾病(NDD)患者腦脊液(CSF)誘導人間充質干細胞(hMSCs)定向分化為神經干細胞(NSCs)的可行性，并觀察、比較不同誘導劑（CSF、生長因子）誘導不同來源間充質干細胞(MSCs)分化為NSCs的天數(shù)及細胞數(shù)。(2)觀察、對比不同來源hMSCs（骨髓源、臍血源）及其經CSF誘導獲得的NSCs通過腰椎穿刺鞘內注射(LP-Ⅱ)移植治療NDD的臨床療效和安全性。
　　方法：(1)選擇研究對象:倫理委員會批準

2、后，在知情同意的前提下，根據(jù)納入和排除標準，選擇2010年10月至2012年10月在徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院住院的、有干細胞治療需求的NDD患者為研究對象。(2)治療分組:根據(jù)骨髓細胞學分析結果，將研究對象分組，其中細胞增生程度、細胞計數(shù)、細胞比例正常者進入骨髓源干細胞治療組，設為A組;否則進入臍血源干細胞治療組，設為B組。(3)獲取MSCs:參照我們的專利及相關文獻，A組取自身骨髓獲取BMMSCs，B組取自愿者臍血獲取UCBMSCs，并用倒

3、置顯微鏡和電鏡觀察、流式細胞分析、免疫組化和熒光免疫組化分析及RT-PCR分析等方法從形態(tài)結構、細胞標志(CD34、CD44、CD45、CD90、Nestin、NSE、GFAP)等層面對目的細胞進行鑒定，并記錄獲取臨床可用數(shù)量級(107/ml)目的細胞所需時間及具體細胞計數(shù)。(4)首次細胞移植治療:取一定量(1.8ml)的MSCs，通過LP-Ⅱ法行首次干細胞移植治療，治療前對患者用特定神經功能量表(PD—UPDRS、Dementia—M

4、MES、MND—改良Norris、MSA—ICARS)，生活活動能力量表(BI)及生活質量量表(EuroQOL)等量表進行評估;同時，在注射細胞前需先留取一定量(4ml)的CSF離心備用。移植后觀察患者是否有副反應及并發(fā)癥，并記錄。(5)誘導獲取NSCs:將A、B兩組的MSCs各分出兩組，記為A1組BMMSCs+CSF誘導組，A2組BMMSCs+生長因子誘導組;B1組UCBMSCs+CSF誘導組，B2組UCBMSCs+生長因子誘導組。參

5、照我們的專利及相關文獻方法，進行誘導，用前面提到的方法對目的細胞進行鑒定，并記錄誘導時間及所得細胞數(shù)量。(6)二次細胞移植治療:操作方法同首次，僅所用細胞改為誘導獲得的NSCs。如果患者需進行多次移植治療，可循環(huán)以上步驟進行，亦可將目的細胞凍存以各患者后用。(7)隨訪:在首次治療后3個月、6個月對患者隨訪，觀察、記錄其神經功能的恢復情況（所用量表同治療前）及移植術后的不良反應，并與前進行比較。
　　結果：(1)共納入NDD患者14

6、人（符合原衛(wèi)生部干細胞臨床試驗研究管理辦法中Ⅰ期臨床試驗病例數(shù)要求），其中A組8人（6男2女）;B組6人（6男0女）。兩組在性別比例、平均年齡無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。(2)A、B兩組患者獲取臨床可用數(shù)量級MSCs所需的時間及所獲得的細胞數(shù)無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。(3) A1、A2、B1、B2四組的MSCs經誘導后均呈現(xiàn)NSCs的形態(tài)結構改變，并可分化為神經元、膠質細胞，且在不同時期有特定的細胞標志表達。其中A1組所得NSCs

7、細胞數(shù)最高，平均為(2.49±0.39)×107/ml，所需時間最短，平均為(13.25±2.82)天，與其它組比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。(4)A、B兩組患者在移植干細胞的平均次數(shù)及平均數(shù)量上無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。(5)移植后可見A、B兩組患者的神經功能均得到不同程度的改善;移植前及首次移植后3月、6月，A、B兩組患者間的BI、EuroQOL得分比較均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，但各組內不同時間點上的BI、EuroQO

8、L得分有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，BI、EuroQOL得分有隨時間變化的趨勢(P＜0.05)，但時間和分組的交互作用沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。(6)移植術后有3例出現(xiàn)過短暫性低熱，A組2例，B組1例，對癥處理即可控制;隨訪至今最長者已達2年余，無一例患者出現(xiàn)繼發(fā)性腫瘤等細胞移植嚴重并發(fā)癥;有4例在隨訪過程中死于其它疾病，A組1例，死于心源性猝死，B組3例，均死于繼發(fā)性肺部感染。
　　結論：(1) NDD患者的CSF可誘導自

9、體骨髓源和異體臍血源MSCs定向分化為NSCs，所獲得的細胞數(shù)亦可滿足臨床需要（與當下較流行的生長因子誘導法比），符合NDD患者的治療需要。(2) NDD患者自體骨髓源、異體臍血源MSCs及其經CSF誘導獲得的NSCs通過LP-Ⅱ法移植治療NDD安全，未見明顯嚴重治療副反應及相關并發(fā)癥出現(xiàn)，可能是一種臨床可以選擇的適用、實用的個體化干細胞治療模式。(3)骨髓源、臍血源干細胞移植治療能促進NDD患者神經功能的恢復，并使NDD患者的日常生活