腦脊液介導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞治療神經(jīng)變性疾病的試驗(yàn)研究.pdf

1、目的：(1)探索神經(jīng)變性疾病(NDD)患者腦脊液(CSF)誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)定向分化為神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)的可行性，并觀察、比較不同誘導(dǎo)劑（CSF、生長(zhǎng)因子）誘導(dǎo)不同來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)分化為NSCs的天數(shù)及細(xì)胞數(shù)。(2)觀察、對(duì)比不同來(lái)源hMSCs（骨髓源、臍血源）及其經(jīng)CSF誘導(dǎo)獲得的NSCs通過(guò)腰椎穿刺鞘內(nèi)注射(LP-Ⅱ)移植治療NDD的臨床療效和安全性。
　　方法：(1)選擇研究對(duì)象:倫理委員會(huì)批準(zhǔn)

2、后，在知情同意的前提下，根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，選擇2010年10月至2012年10月在徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院住院的、有干細(xì)胞治療需求的NDD患者為研究對(duì)象。(2)治療分組:根據(jù)骨髓細(xì)胞學(xué)分析結(jié)果，將研究對(duì)象分組，其中細(xì)胞增生程度、細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞比例正常者進(jìn)入骨髓源干細(xì)胞治療組，設(shè)為A組;否則進(jìn)入臍血源干細(xì)胞治療組，設(shè)為B組。(3)獲取MSCs:參照我們的專(zhuān)利及相關(guān)文獻(xiàn)，A組取自身骨髓獲取BMMSCs，B組取自愿者臍血獲取UCBMSCs，并用倒

3、置顯微鏡和電鏡觀察、流式細(xì)胞分析、免疫組化和熒光免疫組化分析及RT-PCR分析等方法從形態(tài)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞標(biāo)志(CD34、CD44、CD45、CD90、Nestin、NSE、GFAP)等層面對(duì)目的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，并記錄獲取臨床可用數(shù)量級(jí)(107/ml)目的細(xì)胞所需時(shí)間及具體細(xì)胞計(jì)數(shù)。(4)首次細(xì)胞移植治療:取一定量(1.8ml)的MSCs，通過(guò)LP-Ⅱ法行首次干細(xì)胞移植治療，治療前對(duì)患者用特定神經(jīng)功能量表(PD—UPDRS、Dementia—M

4、MES、MND—改良Norris、MSA—ICARS)，生活活動(dòng)能力量表(BI)及生活質(zhì)量量表(EuroQOL)等量表進(jìn)行評(píng)估;同時(shí)，在注射細(xì)胞前需先留取一定量(4ml)的CSF離心備用。移植后觀察患者是否有副反應(yīng)及并發(fā)癥，并記錄。(5)誘導(dǎo)獲取NSCs:將A、B兩組的MSCs各分出兩組，記為A1組BMMSCs+CSF誘導(dǎo)組，A2組BMMSCs+生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)組;B1組UCBMSCs+CSF誘導(dǎo)組，B2組UCBMSCs+生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)組。參

5、照我們的專(zhuān)利及相關(guān)文獻(xiàn)方法，進(jìn)行誘導(dǎo)，用前面提到的方法對(duì)目的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，并記錄誘導(dǎo)時(shí)間及所得細(xì)胞數(shù)量。(6)二次細(xì)胞移植治療:操作方法同首次，僅所用細(xì)胞改為誘導(dǎo)獲得的NSCs。如果患者需進(jìn)行多次移植治療，可循環(huán)以上步驟進(jìn)行，亦可將目的細(xì)胞凍存以各患者后用。(7)隨訪:在首次治療后3個(gè)月、6個(gè)月對(duì)患者隨訪，觀察、記錄其神經(jīng)功能的恢復(fù)情況（所用量表同治療前）及移植術(shù)后的不良反應(yīng)，并與前進(jìn)行比較。
　　結(jié)果：(1)共納入NDD患者14

6、人（符合原衛(wèi)生部干細(xì)胞臨床試驗(yàn)研究管理辦法中Ⅰ期臨床試驗(yàn)病例數(shù)要求），其中A組8人（6男2女）;B組6人（6男0女）。兩組在性別比例、平均年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。(2)A、B兩組患者獲取臨床可用數(shù)量級(jí)MSCs所需的時(shí)間及所獲得的細(xì)胞數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。(3) A1、A2、B1、B2四組的MSCs經(jīng)誘導(dǎo)后均呈現(xiàn)NSCs的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，并可分化為神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞，且在不同時(shí)期有特定的細(xì)胞標(biāo)志表達(dá)。其中A1組所得NSCs

7、細(xì)胞數(shù)最高，平均為(2.49±0.39)×107/ml，所需時(shí)間最短，平均為(13.25±2.82)天，與其它組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。(4)A、B兩組患者在移植干細(xì)胞的平均次數(shù)及平均數(shù)量上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。(5)移植后可見(jiàn)A、B兩組患者的神經(jīng)功能均得到不同程度的改善;移植前及首次移植后3月、6月，A、B兩組患者間的BI、EuroQOL得分比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，但各組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)上的BI、EuroQO

8、L得分有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，BI、EuroQOL得分有隨時(shí)間變化的趨勢(shì)(P＜0.05)，但時(shí)間和分組的交互作用沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。(6)移植術(shù)后有3例出現(xiàn)過(guò)短暫性低熱，A組2例，B組1例，對(duì)癥處理即可控制;隨訪至今最長(zhǎng)者已達(dá)2年余，無(wú)一例患者出現(xiàn)繼發(fā)性腫瘤等細(xì)胞移植嚴(yán)重并發(fā)癥;有4例在隨訪過(guò)程中死于其它疾病，A組1例，死于心源性猝死，B組3例，均死于繼發(fā)性肺部感染。
　　結(jié)論：(1) NDD患者的CSF可誘導(dǎo)自

9、體骨髓源和異體臍血源MSCs定向分化為NSCs，所獲得的細(xì)胞數(shù)亦可滿(mǎn)足臨床需要（與當(dāng)下較流行的生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)法比），符合NDD患者的治療需要。(2) NDD患者自體骨髓源、異體臍血源MSCs及其經(jīng)CSF誘導(dǎo)獲得的NSCs通過(guò)LP-Ⅱ法移植治療NDD安全，未見(jiàn)明顯嚴(yán)重治療副反應(yīng)及相關(guān)并發(fā)癥出現(xiàn)，可能是一種臨床可以選擇的適用、實(shí)用的個(gè)體化干細(xì)胞治療模式。(3)骨髓源、臍血源干細(xì)胞移植治療能促進(jìn)NDD患者神經(jīng)功能的恢復(fù)，并使NDD患者的日常生活