Snk-SPAR途徑在大鼠脾淋巴細胞中的初步研究.pdf

1、T 淋巴細胞的活化是機體啟動適應性免疫反應的關鍵事件，在T細胞發(fā)育階段和成熟T細胞階段，對T細胞受體 (T-cell antigen receptor，TCR)表達水平的動態(tài)調節(jié)對T細胞應答起重要作用，進而對T細胞的發(fā)育、活化、存活、死亡起關鍵性作用。最近研究表明，TCR信號領先于免疫突觸(immunological synapse，IS)的形成，TCR在突觸中央集聚成簇不但促進 TCR信號傳遞，而且加強TCR下調和內化的幾率，提出IS

2、是一類自適應性控制器，在T細胞與特異性配體應答過程中調節(jié) TCR信號的強度和持續(xù)時間。Gascoigne亦證實某些T細胞信號領先于IS成熟之前，但T細胞的充分活化有賴于IS穩(wěn)定持續(xù)的信號。因此對免疫突觸調控的更好的理解將極大的推動 TCR免疫識別和T細胞活化機制的認識。 血清誘導激酶(serum-inducible kinase，Snk)是絲氨酸/蘇氨酸特異性馬球樣激酶(polo-like kinases，Plks)家族成員之

3、一，是G1期Plk；樹突棘相關 Rap-特異性 GTPase-活化蛋白(spine-associated Rap guanosinetriphosphatase activating protein，SPALR)位于樹突棘，SPAR以分子橋梁的形式與突觸后表面蛋白，腳手架蛋白和肌動蛋白相連，是通過調節(jié)肌動蛋白重排控制樹突棘形態(tài)的多域突觸后蛋白。神經元活化能誘Snk表達，Snk靶向樹突棘，與SPAR上的肌動蛋白調節(jié)域相結合使SPAR發(fā)生磷

4、酸化，泛素連接酶識別磷酸化SPAR后，SPAR即被泛素修飾，隨后SPAR經蛋白酶體途徑發(fā)生降解，造成PSD95等腳手架蛋白的丟失，引起樹突棘形態(tài)學變化即由鈍圓形變成狹長狀，這就形成了Snk觸發(fā)泛素化并進而降解SPAR的Snk-SPAR途徑。Snk-SPAR途徑可能對突觸興奮性提高后的突觸功能緩沖起穩(wěn)念調節(jié)作用，該途徑能維持局部突觸界面修飾為基礎的突觸可塑化的穩(wěn)定性，能全面調整神經元活化水平，對Snk-SPAR途徑的調控將成為控制突觸重構

5、的強有力的方法。盡管神經突觸和免疫突觸顯著不同，但二者共享許多相似的特性，神經系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)通過突觸在構成它們瞧兩個細胞之間直接傳遞和轉換強大的分泌控制信號，且這種刺激信號是特異的和保守的；結構上神經突觸和免疫突觸都由中央活化區(qū)和富含粘附分子的周邊區(qū)組成，中央區(qū)具有分泌功能，周邊區(qū)具有內吞作用。至今為止神經生物學家和免疫學家已發(fā)現(xiàn)有些分子為兩者所共有。因此設想在免疫突觸中或許也存在Snk-SPAR途徑調控免疫突觸重構進而影響免疫活化網絡

6、的可塑性。本文是該設想的第一步探索．即探討Snk．SPAR途徑是否存在于免疫系統(tǒng)。 本研究選取健康成年SD大鼠(體重為275±25g，雌雄各半)為研究對象，常規(guī)制備大鼠脾淋巴細胞懸液，調細胞濃度至2×10<'6>/ml。首先用MTT法確定刀豆蛋白A(ConcanavalinA，Con A)激活淋巴細胞的最適濃度之后，將Con A干預的脾淋巴細胞設為7個不同的培養(yǎng)時間點(設空白對照組)，分別收集各時間點淋巴細胞，提取總RNA，用

7、RT-PCR法初步檢測Snk、SPAR mRNA的動態(tài)表達情況(同時設大鼠海馬組織為陽性對照)。在此基礎上，制備脾CD4<'+>T細胞，將Con A干預的CD4<'+>T細胞設為0.5h、1h兩個培養(yǎng)時間點(設空白對照組)，分別收集各時間點CD4<'+>T細胞，提取總蛋白，用Dotblot法進一步在蛋白質水平上驗證Snk、SPAR存在于淋巴細胞中。 實驗結果： 1.確定刀豆蛋白A的最適活化濃度MTT法確定Con A活化

8、淋巴細胞的最適劑量為5μg/ml。 2.Snk mRNA在脾淋巴細胞中的動態(tài)表達未加Con A的10min對照組，脾淋巴細胞中存在Snk mRNA的基礎性表達；用Con A活化的7個時間點，Snk mRNA表達呈動態(tài)變化：培養(yǎng)10min時，Snk條帶清晰，表達高于對照組(P<0.05)，培養(yǎng)達到0.5h時，Snk表達升高且達到高峰(與其他各組比較均具有統(tǒng)計學差異，P<0.05)，培養(yǎng)1h，Snk表達減少，當培養(yǎng)2h時，Snk表

9、達繼續(xù)下降，培養(yǎng)6h、24h、72h時Snk表達恢復到基礎水平，與10min對照組比較已無明顯差異(P>0.05)。 3.SPAR mRNA在脾淋巴細胞中的動念表達不加Con A的10 min對照組淋巴細胞中存在SPAR mRNA的基礎性表達；在Con A活化的7個時間點中，SPAR mRNA表達呈動態(tài)改變：培養(yǎng)10 min時，SPAR條帶清晰(與對照組無差異，P>0.05)，培養(yǎng)0.5 h時，SPAR mRNA較10 min

10、時表達減少(P<0.05)，培養(yǎng)1 h時，SPAR mRNA的表達較0.5 h進一步下降并降至低谷，當培養(yǎng)達到2 h時，SPAR mRNA較1 h表達無差異(P>0.05)，隨著培養(yǎng)時間的進一步延長，SPAR mRNA表達上升，培養(yǎng)6h、24h、72h時SPAR mRNA表達呈持續(xù)增加態(tài)勢。 4．Snk、SPAR蛋白在脾CD4<'+>T細胞中的表達不加Con A的0.5 h對照組CD4<'+>T中存在Snk、SPAR蛋白的基礎性表達；在

11、Con A活化的0.5 h、1 h時間點，檢測到CD4<'+>T中存在Snk蛋白的表達，SPAR蛋白在0.5 h時有表達，在1 h未檢測到。 結論： 1．正常大鼠脾淋巴細胞存在Snk mRNA的基礎表達。受Con A激活時Snk mRNA表達增加，且該表達在激活早期呈先升后漸趨恢復到基礎水平的動態(tài)變化的過程。 2．正常大鼠脾淋巴細胞中存在SPAR mRNA的基礎性表達；在Con A活化的7個時間點中，SPAR