異位ATP合成酶β亞單位單克隆抗體Mc178-Ab抗腫瘤作用及其分子機制研究.pdf

1、目的：血漿纖溶酶原的降解產(chǎn)物--血管抑素是目前腫瘤治療研究的熱點之一。它與異位ATP合成酶結(jié)合，能有效地抑制腫瘤細胞生長，阻止腫瘤血管新生，但半衰期極短和臨床給藥的蛋白劑量大等缺點限制了它的臨床運用。尋找有效的血管抑素替代物，保持抗腫瘤效應(yīng)的同時，克服其缺點，將能在腫瘤臨床治療中發(fā)揮重要作用。為此，本實驗室前期研發(fā)了一種抗體(命名為Mc178-Ab)，它是血管抑素受體--ATP合成酶β催化亞基的單克隆。本論文主要研究了酸性腫瘤環(huán)境下Mc

2、178-Ab的抗腫瘤效應(yīng)，觀察其是否與胞內(nèi)pH值的降低有關(guān)，并對此過程的分子機理進行探討。
　　 方法：本研究運用流式細胞術(shù)篩選異位ATP合成酶表達量差異較大的一組細胞，通過MTT法檢測細胞增殖抑制、Annexin-V/PI雙染法檢測細胞凋亡及劃痕實驗檢測細胞遷移抑制等實驗，檢測Mc178-Ab的抗腫瘤效應(yīng)。同時運用CellTiter-Glo熒光細胞活度試劑檢測膜外ATP合成，使用BCECF-AM熒光探針檢測細胞內(nèi)H+濃度變化，

3、觀察Mc178-Ab對異位ATP合酶合成ATP活性及維持胞內(nèi)酸堿平衡功能的影響。
　　 本研究從受體分子功能的角度探討Mc178-Ab抗腫瘤作用的相關(guān)機制，探討其抗腫瘤作用是否與胞內(nèi)pH值變化相關(guān)，運用鈣離子熒光探針Fura2-AM檢測胞內(nèi)鈣濃度是否受胞內(nèi)酸化的影響。本研究用EIPA建立胞內(nèi)酸化模型，以模擬Mc178-Ab降低細胞內(nèi)的pH值效應(yīng)，并檢測酸化模型對能否引起細胞增殖抑制、誘導(dǎo)細胞凋亡。同時本研究還進一步從信號途徑驗證

4、胞內(nèi)酸化機制，即用免疫印跡法檢測信號途徑的分子磷酸化水平的改變。
　　 結(jié)果：多種細胞膜表面都有異位ATP合成酶的表達，待檢細胞中以A549細胞表達量最高而CHO細胞最低。A549和CHO細胞膜表面的ATP合成酶呈點狀的細胞膜樣分布。Mc178-Ab與待檢測細胞上的異位ATP合成酶結(jié)合后，抑制膜上ATP的合成，降低細胞內(nèi)的pH值，同時誘導(dǎo)細胞凋亡，抑制細胞增殖與遷移。此外，Mc178-Ab還提高了細胞內(nèi)鈣離子濃度。EIPA模擬M

5、c178-Ab對細胞的酸化作用建立的酸化模型，能抑制細胞增殖，但并不能誘導(dǎo)細胞凋亡。Mc178-Ab活性化A549細胞胞內(nèi)的信號分子JNK和p38，降低了ERK和Akt的磷酸化。與A549細胞相比，CHO細胞受Mc178-Ab的影響明顯較低。EIPA降低了信號分子ERK和Akt的磷酸化水平，但并不能活化信號分子JNK和p38。
　　 結(jié)論：實驗結(jié)果表明多種細胞均有異位ATP合酶表達，其表達的多少與細胞良惡性無關(guān)。Mc178-Ab