泛素E3酶atrogin-1-MAFbx通過降解β-catenin抑制LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大和自噬.pdf

1、自噬是溶酶體降解途徑,在許多生物學(xué)過程中起重要作用,例如,饑餓、感染、肌肉萎縮、癌癥、心血管疾病和宿主防御等,在心臟中自噬過程失調(diào)能引起心肌功能障礙和心衰。自噬和泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)是細(xì)胞內(nèi)蛋白降解的兩個主要通路,最新研究表明在心臟中這兩個蛋白降解系統(tǒng)之間存在和協(xié)同和互補的關(guān)系。Atrogin-1/MAFbx是肌肉特異表達(dá)的泛素E3連接酶,由355個氨基酸組成,含有一個功能性的F-box結(jié)構(gòu)域,它與Skp1,Cul1和Roc1結(jié)合

2、形成具有泛素連接酶活性的SCF復(fù)合物。研究表明E3連接酶atrogin-1/MAFbx在肌肉萎縮、心肌肥大和心肌細(xì)胞凋亡中起著重要的作用。但是atrogin-1/MAFbx在心肌細(xì)胞自噬中的作用未見報道。
　　 自噬在固有免疫中起著重要的作用。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)與細(xì)胞上的受體Toll樣受體4(TLR4)結(jié)合,促進β-catenin在細(xì)胞質(zhì)積累并轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi),引起靶基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá),導(dǎo)致心肌肥大

3、。但是LPS在心肌細(xì)胞中是否通過促進β-catenin激活和核轉(zhuǎn)位,激活自噬相關(guān)基因表達(dá)還不清楚。
　　 研究方法:首先原代培養(yǎng)的大鼠乳鼠心肌細(xì)胞用Ad-GFP或Ad-atrogin-1-GFP或Ad-β-catenin-GFP分別感染24h以及Ad-atrogin-1-GFP和Ad-β-catenin-GFP共感染24h后,用LPS(100ng/ml)刺激8h,4％甲醛固定15min,用抗LC3或α-actinin抗體行免疫標(biāo)

4、記并用Alexa Fluor568連接的羊抗兔或抗鼠IgO進行免疫熒光染色,用DAPI進行核染色。通過數(shù)LC3陽性點和標(biāo)準(zhǔn)化橫切面積對自噬小體進行定量,用image-pro plus6.0軟件定量含自噬小體細(xì)胞的百分率以及細(xì)胞平均面積；Trizol法抽提總RNA,用大鼠特異引物L(fēng)C3,Atg12,Atg4b,Bnip1,Bnip3和vp34進行實時定量RT-PCR分析,實驗重復(fù)三次；用40μg的細(xì)胞總蛋白和抗LC3抗體或抗β-caten

5、in抗體進行Western blotting檢測。用體外GST pull-down和免疫共沉淀實驗分別證明atrogin-1/MAFbx與β-catenin相互作用。
　　 研究結(jié)果:(1)LPS誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的大鼠乳鼠心肌細(xì)胞肥大和自噬小體形成。(2)Atrogin-1過表達(dá)可抑制LPS誘導(dǎo)的心肌肥大、自噬小體形成和自噬相關(guān)基因如LC3,Atg12,Atg4b,Bnip1,和vp34表達(dá)。Western blotting結(jié)果表明

6、atrogin-1也可抑制LPS誘導(dǎo)LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)換。(3)過表達(dá)的β-catenin可促進LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大、自噬小體形成及許多自噬相關(guān)基因包括LC3、Atg12、Atg4b、Vps34(aclassⅢ PI3K)和Bnip1的表達(dá)。Western blotting表明過表達(dá)β-catenin也可促進LPS誘導(dǎo)的LC3-Ⅰ到LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)換。(4)過表達(dá)atrogin-1可明顯抑制LPS誘導(dǎo)β-catenin介導(dǎo)的心

7、肌肥大、自噬小體形成、自噬相關(guān)基因的表達(dá)及LC3-Ⅰ到LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)換。(5)Western blotting表明過表達(dá)atrogin-1可降低內(nèi)源性β-catenin蛋白水平且呈劑量依賴關(guān)系。(6)GST pull-down和免疫共沉淀實驗證明atrogin—1與β-catenin直接相互作用,主要通過atrogin-1的60-160氨基酸。
　　 結(jié)論:本研究明確atrogin-1直接與β-catenin相互作用,下調(diào)內(nèi)源性