用GSK-3β特異的RNAi腺病毒載體研究Wnt-β-catenin信號途徑對人甲狀腺細胞增殖凋亡的影響.pdf

1、目的： 以糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)特異的RNA干擾(RNAi)腺病毒表達載體作為研究工具，從轉(zhuǎn)錄后水平抑制GSK-3β基因表達，初步探討Wnt/β-連環(huán)蛋白(Wnt/β-catenin)，信號途徑對人甲狀腺細胞增殖凋亡的影響。 方法： 設(shè)計合成針對GSK-3βmRNA序列的短發(fā)夾RNA(shRNA)編碼序列，克隆到腺病毒穿梭質(zhì)粒中，然后通過體外同源重組構(gòu)建重組RNAi腺病毒表達載體，在HEK293A細

2、胞中包裝并擴增病毒、空斑實驗法測定病毒滴度；腺病毒感染原代培養(yǎng)人甲狀腺細胞，Western blot法檢測其對GSK-3β表達的抑制效應(yīng)，并探討不同感染復(fù)數(shù)(MOI)及病毒感染時間對GSK-3β的抑制效應(yīng)；利用RNAi腺病毒抑制GSK-3β表達，溴脫氧尿苷(BrDU)法檢測細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞凋亡，探討Wnt/β-catenin信號途徑對人甲狀腺細胞增殖和凋亡的影響。 結(jié)果： 1.成功構(gòu)建了GSK-3β特異的RN

3、Ai腺病毒表達載體，在HEK293A細胞中包裝、擴增腺病毒，獲得高滴度腺病毒上清，測定擴增第二代的病毒液滴度在1.6×1010pfu～5.0×1010pfu之間，可滿足后續(xù)實驗需要。 2.RNAi腺病毒感染人甲狀腺細胞后可使GSK-3β表達量明顯下降，RNAi腺病毒MOI值為100時可實現(xiàn)對細胞GSK-3β表達的有效抑制；RNAi腺病毒感染后48h開始檢測到GSK-3β表達量下降，且隨時間延長GSK-3β表達量進一步減少，抑制效

4、應(yīng)可持續(xù)至少6天；RNAi腺病毒感染人甲狀腺細胞后β-catenin表達量顯著增加。 3.腺病毒感染人甲狀腺細胞1day、3day、5day、7day后，RNAi腺病毒組與空病毒組相比，細胞增殖率明顯增加(P<0.05)；但流式細胞檢測結(jié)果提示RNAi腺病毒感染對細胞凋亡的影響不明顯。 結(jié)論： 構(gòu)建的GSK-3β特異的RNAi腺病毒表達載體能有效抑制GSK-3β基因表達，可以作為研究wnt/β-catenin信號