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1、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文CELO禽腺病毒載體的構(gòu)建及fiber1部分片段的原核表達(dá)姓名：王鳳雪申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：王云峰20050601AbstractChickenembryolethalorphanvirus(CELO)isclassifiedasafowladenovirustype1(FAV1)andisthemajorsubjectofavianadenovirologyformanyyearsAnd
2、nowitisbeingdevelopedasavectorsystemforvaccinedesignThefiber1andfiber2genesofCELOareresponsibleforviralvirulenceandimmunogenicityTheCELOgenomewithdisruptedfiber1geneproducedvirusthatwascapableofinfectchickencells，butlost
3、theabilitytoefficientlytransducehumancellsBasedonthischaracter，areplicationadenovirusvectorwasgeneratedAndthefiber1carboxyterminalknobswasexpressedinEcolisystemAfragment361lbp(27150bpto30760bp)(namedFc)comprisingoffiber1
4、geneandflankingsequences，wasamplifiedbyPCRfromthegenomeofCELOclonedintopMDl8一T，yieldingpTFcPlasmidpTFcwasdigestedwjtllXhol，resultinginadeletionof592bpTheCMVeGFPexpressioncassettewasreleasedfromplasmidpEGFPN1usingAfllland
5、AselThenthetwofragmentswerebluntedandreligated，obtaintingpTF—CMVeGFPThepTFcCMVeGFPandCELOgenomieDNAwereusedtocotransfect293一TcellsThentherecombinantviruswasrescuedbyinfectingchickenembryoedfibroblasts(CEFs)orchickenkidne
6、ycells(CKCs)，givingrisetoarecombinantvirusCELOFeGFP，whichwasidentifiedbygreenfluorescenceandPCRThe807bpimmunodominantregionofCELOfiber1protein(AF807)wasamplifiedfromFcfragmentandclonedintoaprokaryoticexpressionvectorpGEX
7、6p1toobtainpGEXAF807ThetargetfusionproteinwasproducedbyinducingpGEXAF807transformed最coliceilswithIPTGAndSDSPAGEanalysisshowedthattheexpressedfusionproteinexistedinformofinclusivebodiesanditsmolecularweightwasabout546kuTh
8、efusionproteinaccountsfor357％ofthetotalbacterialproteinsWesternblotanalysisshowedthattheproteinhasgoodantigenicityTheCELOVvectormaybeveryusefulbothforinvitroandinvivogenetherapyapplicationsAndtheexpressedproteincanbeused
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