泰山松化粉多糖的成分分析及其對(duì)B亞群禽白血病的免疫調(diào)理作用.pdf

1、禽白血病(Avian Leucosis)是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus，ALV)和禽肉瘤病毒(Avian Sarcoma Virus，ASV)群中的病毒感染引起的多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱。該病在蛋雞、肉雞以及我國(guó)地方品系雞群中都有發(fā)生，造成雞群生產(chǎn)性能降低、免疫抑制、腫瘤性死亡等危害，尤其是ALV感染引起的亞臨床感染，導(dǎo)致感染雞生產(chǎn)性能低下和免疫抑制，從而引起其它病毒和細(xì)菌的混合感染或繼發(fā)感染，導(dǎo)致繼發(fā)感染或共感

2、染，給養(yǎng)禽業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)于禽白血病的防制，目前尚缺乏有效的藥物和疫苗，只能通過(guò)種群凈化來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)該病的控制。在過(guò)去的幾十年中，由于未能采取有效地凈化措施，禽白血病在養(yǎng)禽地區(qū)廣泛的流行和散播，致使對(duì)其防控更加耗時(shí)耗力。因此，亟需探索新的方法控制ALV的散播、減少感染ALV感染的亞臨床癥狀，減少該病帶來(lái)的危害。目前，多種植物多糖作為新型的添加劑被證明有抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗輻射等多種生物學(xué)作用。本實(shí)驗(yàn)室之前的研究發(fā)現(xiàn)泰山松花粉多糖

3、(Taishan pine pollen polysaccharose，TPPPS)能顯著增強(qiáng)奇異變形桿菌和禽波氏桿菌亞單位疫苗的免疫效果，促使更強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng);提高獺兔的生產(chǎn)性能;對(duì)免疫抑制小鼠有免疫恢復(fù)作用。然而，前面所用TPPPS為水提醇沉法所提的總多糖，至今仍不清楚TPPPS中的有效活性成分及相應(yīng)的生物學(xué)特性，因此限制了人們對(duì)TPPPS的認(rèn)識(shí)及應(yīng)用。
　　基于以上考慮，本研究首先分析了TPPPS的成分和理化特性，并鑒定了

4、每種成分的生物學(xué)活性;進(jìn)一步對(duì)不同組份抑制B亞群禽白血病病毒(ALV-B)增殖的特性進(jìn)行了分析;最終，通過(guò)建立感染感染ALV-B的雞免疫抑制模型，探究了TPPPS對(duì)ALV-B誘導(dǎo)的免疫抑制的免疫調(diào)理和恢復(fù)作用，為探索研發(fā)防制禽白血病的新途徑奠定基礎(chǔ)。本研究分以下三部分內(nèi)容:
　　1.TPPPS部分理化特性和生物學(xué)活性的分析
　　1.1 TPPPS的柱層析純化及各組分分子量和單糖組成的檢測(cè)
　　為進(jìn)一步研究TPPPS的功

5、能和發(fā)揮作用的機(jī)理，本研究將粗提的多糖用DEAE纖維素柱和Sephadex G-200凝膠柱進(jìn)一步的純化。結(jié)果顯示，松花粉多糖主要包括三種組分（分別命名為TPPPS1、TPPPS2和TPPPS3），并且分離得到了這三種組分的均一多糖。
　　利用高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)和高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)三種多糖組分的分子量和單糖組成。結(jié)果表明TPPPS1、TPPPS2和TPPPS3的分子量分別為56、25和128 kDa。TPP

6、PS由甘露糖、核糖、木糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖等構(gòu)成，TPPPS1-3組分之間各單糖組成的種類和比例存在明顯不同。以上研究結(jié)果提示這三種組份可能具有不同的生物學(xué)特性。
　　1.2 TPPPS體外抗氧化性、免疫增強(qiáng)活性、抗病毒活性的檢測(cè)
　　TPPPS各組分的分子量和單糖組成差異顯著，表明TPPPS1-3的生物學(xué)活性可能存在明顯的差異。為了進(jìn)一步了解TPPPS的生物活性，本研究對(duì)TPPPS、TPPP

7、S1、TPPPS2和TPPPS3的三種體外生物活性進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，TPPPS2和TPPPS3顯著促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖，并且TPPPS3的效果強(qiáng)于TPPPS2; TPPPS3增強(qiáng)細(xì)胞因子白介素2(IL-2)和腫瘤壞死因子（TNF）的分泌，而TPPPS2僅可以顯著提高IL-2的分泌;值得注意的是，TPPPS1沒(méi)有以上作用，但誘導(dǎo)NO產(chǎn)生的效果最為顯著，表明TPPPS1具有最顯著的抗氧化活性;50μg/mLTPPPS3對(duì)ALV-B增殖作

8、用最為顯著，并且作用的主要時(shí)期是在病毒的吸附期。本研究為使用TPPPS1-3合理比例的進(jìn)一步研究可促進(jìn)有效的免疫調(diào)節(jié)劑的開發(fā)和分析TPPPS的體外的抗病毒機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　2.TPPPS體外抗病毒活性機(jī)制的分析
　　2.1阻斷ELISA方法的建立
　　為研究TPPPS對(duì)ALV-B增殖的顯著抑制主要發(fā)生在病毒吸附宿主細(xì)胞的過(guò)程中的機(jī)制，本研究根據(jù)ALV-B的吸附過(guò)程中起重要作用的兩個(gè)蛋白，病毒的囊膜糖蛋白gp85和宿

9、主的受體蛋白tv-b，建立兩個(gè)ELISA方法。用原核表達(dá)的方法表達(dá)出gp85和tv-b蛋白，并制備這兩個(gè)蛋白的多克隆抗體，用這兩個(gè)蛋白和抗體建立兩個(gè)受體-病毒ELISA方法（方法Ⅰ:gp85—tv-b—tv-b抗體—酶標(biāo)二抗;方法Ⅱ:tv-b—gp85—gp85抗體—酶標(biāo)二抗）。用方陣試驗(yàn)確定ELISA方法的各個(gè)條件，結(jié)果顯示方法Ⅰ中g(shù)p85，tv-b，tv-b抗體的濃度，陰陽(yáng)性臨界值分別是16μg/mL，32μg/mL，1∶80，0.

10、178，方法Ⅱ中tv-b，gp85，gp85抗體的濃度分別是32μg/mL，32μg/mL，1∶80，0.194，封閉液和TMB顯色時(shí)間都是5％脫脂奶粉和15 min。本試驗(yàn)成功建立兩個(gè)ELISA方法用于分析TPPPS體外抗病毒活性機(jī)制。
　　2.2 TPPPS體外抗病毒活性機(jī)制的分析
　　利用建立的兩個(gè)受體-病毒ELISA方法，在gp85蛋白（或tv-b蛋白）包被ELISA板之后加入200μL不同濃度(100，101，10

11、2，103，104，105μg/mL)的TPPPS3溶液孵育，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)觀察結(jié)果的變化。結(jié)果顯示，TPPPS3可以顯著降低ELISA方法Ⅰ中的P/N值，對(duì)方法Ⅱ的影響不顯著，這表明多糖能與病毒的gp85蛋白的結(jié)合，并且不能與tv-b受體蛋白結(jié)合，這種結(jié)合干擾了病毒與tv-b受體蛋白的結(jié)合，這是TPPPS抑制了病毒擴(kuò)增的機(jī)制之一。本研究為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)TPPPS在ALV-B吸附宿主細(xì)胞過(guò)程中的作用，為研究TPPPS抑制ALV-B在雛雞體內(nèi)增

12、殖的機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為TPPPS在禽白血病防制方面的應(yīng)用提供了依據(jù)。
　　3.TPPPS對(duì)感染ALV-B雛雞免疫抑制模型的調(diào)理作用
　　3.1感染ALV-B雛雞免疫抑制模型的建立
　　雞群感染ALV后可造成1-2％的死亡率（偶爾可達(dá)20％或更高），而大部分雞只有亞臨床感染，主要是表現(xiàn)是生產(chǎn)性能下降和免疫抑制。本研究選用50只1日齡雛雞感染ALV-B，分別在感染后1-9周監(jiān)測(cè)感染雞的各項(xiàng)生理指標(biāo)的變化，建立免疫抑制模型，檢

13、測(cè)指標(biāo)包括:發(fā)病率與死亡率，體重與免疫器官指數(shù)，抗ALV-B特異性抗體水平，γ干擾素(IFN-γ)與白介素2(IL-2)水平，T淋巴細(xì)胞增殖率，CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞亞群比例等。結(jié)果顯示通過(guò)對(duì)以上指標(biāo)的檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)感染雞死亡，但其生長(zhǎng)狀況顯著差于正常雞，并且免疫器官發(fā)育遲緩，免疫反應(yīng)不明顯，淋巴細(xì)胞活性降低，CD4+和CD4+/CD8+顯著下降等。結(jié)果表明，感染雞的免疫系統(tǒng)受到顯著地免疫抑制，免疫抑制模型建立成功，為分析感染ALV-B

14、雛雞的免疫反應(yīng)變化提供了依據(jù)。
　　3.2 TPPPS對(duì)免疫抑制模型雛雞的調(diào)理作用
　　據(jù)報(bào)道TPPPS對(duì)環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的免疫抑制小鼠有免疫恢復(fù)作用，本研究通過(guò)給感染ALV-B的免疫抑制模型雛雞頸部皮下注射TPPPS，分析多糖對(duì)免疫抑制雞的免疫調(diào)理作用，同時(shí)在雛雞一周齡后免疫新城疫病毒(NDV)疫苗，之后檢測(cè)各項(xiàng)免疫指標(biāo)，用以分析TPPPS對(duì)感染ALV-B雛雞免疫抑制模型的調(diào)理恢復(fù)作用。研究結(jié)果顯示，TPPPS組雛雞的體重和免