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文檔簡介
1、為制備相應(yīng)的特異性抗體用于快速分離鑒定A/B亞群的ALV,本實驗分別克隆表達(dá)了A亞群禽白血病病毒(ALV-A)SDAU09C1株和B亞群禽白血病病毒(ALV-B)SDAU09C2株的囊膜gp85基因,嘗試應(yīng)用gp85基因的表達(dá)產(chǎn)物免疫家兔來獲取大量高效價的特異抗血清。
根據(jù)已發(fā)表A亞群禽白血病病毒(ALV-A)SDAU09C1株和B亞群禽白血病病毒(ALV-B)SDAU09C2株基因序列,利用primer5.0設(shè)計并合成一
2、對引物。利用PCR方法擴增兩毒株的囊膜gp85基因片段,將目的片段克隆至pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21(DH5α),構(gòu)建重組載體。經(jīng)核酸序列測定,克隆的基因片段分別長1017bp,1038bp,為gp85基因開放性讀碼框的全長序列,分別編碼339,346個氨基酸。將gp85基因片段分別連接至pET-32a(+)表達(dá)載體中,經(jīng)抗性篩選、PCR擴增、限制性內(nèi)切酶分析,篩選獲得目的片段正向插入、有正確讀碼框的陽性克隆,分別命名為p
3、ET-SDAU09C1-gp85和pET-SDAU09C2-gp85。陽性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Ecoli.BL21(Rosetta)宿主菌,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE電泳表明重組蛋白以包涵體的形式出現(xiàn)。通過誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化,確立了最佳的誘導(dǎo)條件為30℃,1mMIPTG濃度,誘導(dǎo)表達(dá)5h。因融合蛋白氨基端含有6個組氨酸,用鎳金屬親和層析純化目的蛋白。取A亞群禽白血病病毒(ALV-A)SDAU09C1株和B亞群禽白血病病毒(ALV-B)
4、SDAU09C2株的陽性雞血清分別進(jìn)行Western blotting檢測,結(jié)果顯示表達(dá)的重組蛋白是特異性的。
將純化的融合蛋白按常規(guī)方法免疫家兔,三免后一周,心臟采血分離血清。取兩種抗血清進(jìn)行間接免疫熒光反應(yīng)(IFA)測定效價,效價均可達(dá)1:500,其中SDAU09C1抗血清在1:100稀釋時效果較好,而SDAU09C2抗血清在1:50稀釋時效果較好。取抗血清最佳稀釋度與本實驗室保存的A亞群禽白血病病毒SDAU09E1株
5、,SDAU09C3株,和J亞群禽白血病病毒HN0001株進(jìn)行IFA區(qū)分鑒定。結(jié)果不論是A亞群SDAU09C1血清還是B亞群SDAU09C2血清都能與A或B亞群的不同毒株發(fā)生陽性反應(yīng),但效價不同。然而,二種血清都不與J亞群的NX0101株發(fā)生反應(yīng)。
用制備的兩種抗血清,采用固定病毒(200TCID50)稀釋血清的方法進(jìn)行交叉中和反應(yīng)。結(jié)果顯示,抗SDAU09C1株gp85產(chǎn)生的兔血清的抗體效價比較高,對兩個分離株都有較高的中
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