蛇床子素、白藜蘆醇對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及其與細(xì)胞周期和Bcl-2家族關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、植物雌激素(PE)為一系列來(lái)自植物的非甾體類復(fù)合物，存在于大部分植物、水果和蔬菜中，PE的結(jié)構(gòu)和甾體類激素相似，可與體內(nèi)的雌激素受體結(jié)合，但其活性較人類雌激素弱102～105倍，有雌激素和抗雌激素雙重效應(yīng)。大量研究表明，絕經(jīng)期或卵巢切除術(shù)后婦女應(yīng)用雌激素替代治療(estrogen replacement therapy, ERT)可明顯減輕婦女絕經(jīng)期癥狀、預(yù)防骨質(zhì)疏松和心血管疾病發(fā)病率。但長(zhǎng)期應(yīng)用雌激素易產(chǎn)生高血凝狀態(tài)、高血壓、水腫等副

2、反應(yīng)，并增加乳腺癌及子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病危險(xiǎn)。為此，人們?cè)谥铝τ趯で蟠萍に靥娲镏?，發(fā)現(xiàn)植物雌激素可減輕絕經(jīng)期癥狀卻不具有上述雌激素的副反應(yīng)。 目的：本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期致力于植物雌激素方面的研究，并取得一定的進(jìn)展。本課題組研究蛇床子素、白藜蘆醇體外活性及其植物雌激素樣作用，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。 方法： 1. MTT法和SRB法檢測(cè)蛇床子素、白藜蘆醇對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖/抑制作用以及對(duì)其它腫瘤細(xì)胞的活性 取經(jīng)

3、無(wú)酚紅RMPI1640(內(nèi)含5％CDT-FBS)培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24h后，加入不同濃度的蛇床子素、白藜蘆醇，48h后MTT法和SRB法測(cè)定蛇床子素、白藜蘆醇在體外對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖/抑制率以及對(duì)其它腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率IC50或GI50。用MTT法檢測(cè)蛇床子素、白藜蘆醇對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響。 2. 倒置光顯微鏡、熒光顯微鏡觀察蛇床子素、白藜蘆醇作用后MCF-7細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變 在

4、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞中加入不同濃度蛇床子素、白藜蘆醇(0.5×10-4mol/L～1.0×10-4mol/L)，作用于MCF-7細(xì)胞48h，Giemsa染色后倒置光顯微鏡觀察照相并保留結(jié)果。同法進(jìn)行Hoechst33342染色，以紫外光(340nm)激發(fā)Hoechst，熒光顯微鏡觀察照相并保留結(jié)果。 3. 瓊脂糖凝膠電泳分析蛇床子素、白藜蘆醇對(duì)MCF-7細(xì)胞染色體DNA斷裂的影響。 在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞，加入不同濃度蛇床

5、子素、白藜蘆醇(0.5×10-4mol/L～1.0×10-4mol/L，)作用48h后抽提樣本DNA，于1.5％瓊脂糖膠電泳，電泳完成后用紫外光下觀察并照相。 4. 流式細(xì)胞術(shù)分析蛇床子素、白藜蘆醇對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡率、增殖指數(shù)的檢測(cè)以及對(duì)細(xì)胞周期的影響。 取經(jīng)無(wú)酚紅RMPl1640(內(nèi)含5％CDT-FBS)培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞，加入不同濃度的蛇床子素、白藜蘆醇，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度的蛇床子素、白藜蘆醇作

6、用24h、48h后對(duì)細(xì)胞的影響。 5. 免疫組化SP法檢測(cè)蛇床子素(0.8×10-7mol/L～3.2×10-7mol/L)、白藜蘆醇(0.5×10-7mol/L～2.0×10-7mol/L)作用MCF-7細(xì)胞48h后對(duì)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白的表達(dá)。 6. RT-PCR法檢測(cè)不同濃度蛇床子素、白藜蘆醇對(duì)MCF-7細(xì)胞PCNA、Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)的影響。 7. Western-blot法檢測(cè)不

7、同濃度蛇床子素、白藜蘆醇對(duì)MCF-7細(xì)胞P21、Caspase-3、CDK2蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果： 1. 蛇床子素、白藜蘆醇對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖/抑制作用 本課題通過(guò)體外MTT法發(fā)現(xiàn)低濃度的蛇床子素、白藜蘆醇對(duì)MCF-7細(xì)胞有促增殖作用，其最高增值濃度分別為1.6×10-7mol/L、1.0×10-7mol/L；而高濃度則對(duì)MCF-7細(xì)胞表現(xiàn)為抑制作用，其IC50分別為7.47×10-5mol/L、8.70×1

8、0-5mol/L。在不同濃度的蛇床子素、白藜蘆醇作用下，通過(guò)觀察對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響，發(fā)現(xiàn)其增殖/抑制活性具有量效關(guān)系。此外通過(guò)MTT法和SRB法還檢測(cè)出高濃度的蛇床子素、白藜蘆醇對(duì)多種腫瘤細(xì)胞都有抑制作用。 2. 蛇床子素、白藜蘆醇不同濃度組對(duì)MCF-7細(xì)胞周期的影響 本文采用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)不同濃度組的蛇床子素、白藜蘆醇作用24h和48h后對(duì)MCF-7細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示與空白對(duì)照組相比較，蛇床子素、白藜

9、蘆醇低濃度組均可使MCF-7細(xì)胞G2+S期DNA含量比例明顯增多，蛇床子素高濃度組使細(xì)胞周期阻斷在S期；白藜蘆醇高濃度組使細(xì)胞周期阻斷在G1期。 3. 蛇床子素、白藜蘆醇高濃度誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞的凋亡 高濃度的蛇床子素、白藜蘆醇(0.5×10-4mol/L～1.0×10-4mol/L)作用于MCF-7細(xì)胞48小時(shí)，Giemsa染色后顯微鏡觀察，可見(jiàn)細(xì)胞核形態(tài)呈現(xiàn)細(xì)胞凋亡的典型特征：核膜皺縮，核固縮，核碎裂；用熒光染料Ho

10、echst 33342對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，在紫外光激發(fā)下發(fā)藍(lán)色熒光，熒光顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)MCF-7細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。并且隨著蛇床子素、白藜蘆醇濃度的增加，細(xì)胞凋亡形態(tài)的變化愈顯著，凋亡細(xì)胞的比例逐漸增多，具有劑量依賴性。在經(jīng)典的DNA降解斷裂檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)不同濃度的蛇床子素、白藜蘆醇(0.5×10-4mol/L～1.0×10-4mol/L)作用于MCF-7細(xì)胞48小時(shí)后，抽提富集小分子量DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，呈現(xiàn)典型的“DNA梯子

11、”(DNA ladder)。通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞的DNA含量進(jìn)行測(cè)定，可見(jiàn)經(jīng)不同濃度的蛇床子素、白藜蘆醇(0.5×10-4mol/L～1.0×10-4mol/L)作用于MCF-7細(xì)胞48小時(shí)后，對(duì)細(xì)胞DNA進(jìn)行PI熒光染色，于正常G0/G1細(xì)胞群前出現(xiàn)DNA低染細(xì)胞群，稱為“A0細(xì)胞群"或“亞G1細(xì)胞群，Sub-G1”即凋亡細(xì)胞群，該現(xiàn)象被認(rèn)為是細(xì)胞發(fā)生凋亡的標(biāo)志之一，且凋亡細(xì)胞的比例隨著蛇床子素、白藜蘆醇濃度的升高而增大，呈一定的劑量

12、依賴性。綜上結(jié)果可以認(rèn)為蛇床子素、白藜蘆醇高濃度作用于MCF-7細(xì)胞時(shí)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。 4. 蛇床子素、白藜蘆醇低濃度促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的增殖 本文采用免疫組化SP法檢測(cè)蛇床子素(0.8×10-7mol/L～3.2×10-7～mol/L)、白藜蘆醇(0.5×10-7mol/L～2.0×10-7mol/L)作用MCF-7細(xì)胞48小時(shí)后對(duì)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示PCNA陽(yáng)性顆粒位于胞核，PCNA表達(dá)

13、的陽(yáng)性率，蛇床子素1.6×10-7mol/L作用組為0.245，白藜蘆醇1.0×10-7mol/L組為0.272，對(duì)照組為0.087(P<0.05)。說(shuō)明作用組和對(duì)照組MCF-7細(xì)胞PCNA表達(dá)的陽(yáng)性率之間存在顯著性差異，作用組MCF-7細(xì)胞PCNA表達(dá)較對(duì)照組顯著增加。 5. 蛇床子素、白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞增殖/凋亡相關(guān)基因PCNA、Bcl-2和Bax的mRNA表達(dá)的影響 本文觀察了蛇床子素、白藜蘆醇對(duì)MCF-7細(xì)胞相關(guān)基因

14、PCNA、Bcl-2和Bax的mRNA表達(dá)的影響。RT-PCR結(jié)果顯示高濃度(0.5×10-4mol/L～1.0×10-4mol/L)蛇床子素、白藜蘆醇能增加MCF-7細(xì)胞中Bax的mRNA的表達(dá)，同時(shí)降低了PCNA和Bcl-2的mRNA的表達(dá)，與對(duì)照組相比均有顯著性差異。而低濃度組增加PCNA、Bcl-2的mRNA表達(dá)，降低Bax的mRNA的表達(dá)，且與對(duì)照組相比均有顯著性差異。提示低濃度蛇床子素、白藜蘆醇通過(guò)上調(diào)PCNA和Bcl-2

15、mRNA的表達(dá)，協(xié)同下調(diào)凋亡基因Bax的表達(dá)，從而促進(jìn)：MCF-7細(xì)胞增殖。其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用則是通過(guò)上調(diào)Bax的mRNA，下調(diào)PCNA和Bcl-2 mRNA的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。 6. 蛇床子素、白藜蘆醇對(duì)凋亡相關(guān)蛋白P21、Caspase-3及周期相關(guān)蛋白CDK2表達(dá)的影響 本文觀察了蛇床子素、白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞Caspase-3、P21及CDK2的蛋白表達(dá)的影響。經(jīng)不同濃度的蛇床子素、白藜蘆醇(0.5×10-4mol/L～1

16、.0×10-4mol/L)作用于MCF-7細(xì)胞48h，Western-blot結(jié)果顯示高濃度的蛇床子素、白藜蘆醇可上調(diào)P21、Caspase-3蛋白表達(dá)，下調(diào)CDK2蛋白表達(dá)，且呈一定的劑量依賴性。 結(jié)論：蛇床子素、白藜蘆醇的高濃度和低濃度組對(duì)MCF-7細(xì)胞分別表現(xiàn)為兩種不同的作用：高濃度抑制細(xì)胞生長(zhǎng)；低濃度對(duì)細(xì)胞具有促增殖作用。低濃度作用組使細(xì)胞S+G2M期比例增加；蛇床子素高濃度組可將細(xì)胞阻斷在S期，白藜蘆醇高濃度組則將細(xì)胞