禽白血病病毒(ALV)的分離與鑒定及針對A、B亞群ALV gp85囊膜蛋白單克隆抗體的研制.pdf

1、禽白血病是由禽白血病病毒(avianleukosisvirus，ALV)引起的。該病不僅能引起雞的多種腫瘤性疾病，還能引起感染雞的免疫抑制，具有可垂直傳播的特性。目前，種群凈化是防控禽白血病最有效的途徑。由于我國從未對ALV采取過有效的凈化措施，雞群、尤其地方品系中存在ALV感染的可能性很大。在過去十幾年中，我國對J亞群禽白血病的流行狀況做了大量報道。但對J亞群以外其它亞群ALV研究的還比較少。
　　 本研究首先采用DF1細胞接

2、種、檢測p27抗原、聚合酶鏈式反應(PCR)的方法，從各地送檢的疑似ALV的病料中分離到7株ALV毒株。為了確定7株分離株的亞群類型，克隆和測序了其gp85基因，并將其與已知的ALV各亞群的gp85基因序列進行了同源性比較。結果表明:7株分離株中2株為ALV-A毒株、4株為ALV-B毒株和1株為ALV-J毒株。這說明我國雞群中存在A、B亞群ALV的感染。
　　 本研究設計了兩對特異性引物，應用PCR方法分別擴增ALV-A和ALV

3、-Bgp85蛋白編碼區(qū)，經克隆測序正確后，將目的基因分別克隆入原核表達載體pET-32a(+)和pGEX-6P-1構建成兩種不同融合表達方式的重組質粒，分別命名為pET-A-gp85、pET-B-gp85、pGEX-A-gp85和pGEX-B-gp85。重組質粒轉化BL21(DE3)或BL21宿主菌后，用IPTG進行誘導表達，經SDS-PAGE鑒定，攜帶pET-A-gp85、pGEX-A-gp85和pGEX-B-gp85等三種表達載體的

4、重組菌能夠正確表達相應的重組蛋白。
　　 將重組菌用IPTG大量誘導表達，分別用High-AffinityNi-IDAResin和High-AffinityGSTResin進行重組蛋白純化。將純化后的重組蛋白用弗氏完全佐劑乳化后免疫6周齡BALB/c小鼠，間隔兩周加強免疫一次（第二、三次免疫用弗氏不完全佐劑）。第三次免疫兩周后用等量抗原（無佐劑）腹腔免疫一次，三天后取小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0融合。用純化的蛋白包被ELIS

5、A反應板，對融合成功的雜交瘤細胞進行篩選。選取陽性孔進行亞克隆，獲得穩(wěn)定分泌抗ALV-Agp85抗原的單抗雜交瘤細胞系2株，命名為A5D1和A6C6;獲得穩(wěn)定分泌抗ALV-Bgp85抗原的單抗雜交瘤細胞系2株，命名為B2C11和B6B7。經測定，A5D1和A6C6腹水間接ELISA效價均達到1:204800，B2C11和B687效價均達到1:409600。單抗A5D1、B2C11和B6B7亞類為IgG1，A6C6為IgG2a。Weste