呂氏泰勒蟲TISP基因的克隆、轉(zhuǎn)染及其在Vero細(xì)胞的定位.pdf

1、羊泰勒蟲病(Ovine and caprine theileriosis)是媒介蜱傳播的由泰勒科泰勒屬的原蟲寄生于綿羊和山羊巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞內(nèi)所引起的疾病的總稱。嚴(yán)重影響了畜牧業(yè)的發(fā)展。本研究從呂氏泰勒蟲裂殖子cDNA表達(dá)文庫中克隆出TlSP基因，通過構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和純化，得到重組rTlSP抗原。經(jīng)Western-blot方法分析證實(shí)TlSP表達(dá)蛋白的反應(yīng)性。經(jīng)過真核轉(zhuǎn)染用激光共聚焦顯微技術(shù)對其在Vero細(xì)

2、胞中表達(dá)蛋白進(jìn)行定位，最后建立檢測羊泰勒蟲的間接ELISA方法。為今后羊泰勒蟲病的免疫學(xué)診斷和基因工程疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。
　　克隆呂氏泰勒蟲(Theileria luwenshuni)TlSP基因的功能區(qū)片段，以呂氏泰勒蟲cDNA表達(dá)文庫為模板，PCR擴(kuò)增出TlSP基因片段，構(gòu)建成pET-30a-TlSP重組質(zhì)粒，通過誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了可溶性表達(dá)蛋白，并對其用鎳柱進(jìn)行親和層析純化，得到重組rTlSP抗原，用Western-blot

3、分析了TlSP表達(dá)蛋白與尤氏泰勒蟲(T.uilenbergi)、綿羊泰勒蟲(T.ovis)、以及環(huán)形泰勒蟲（T.annulata）陽性血清均有交叉反應(yīng)。證實(shí)TlSP同源基因也存在于環(huán)形泰勒蟲、尤氏泰勒蟲和綿羊泰勒蟲中。
　　為研究呂氏泰勒蟲TlSP基因在Vero細(xì)胞的表達(dá)與定位，構(gòu)建了pEGFP-N1-TlSP重組表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后，用Western-blot印跡驗(yàn)證了該蛋白在Vero細(xì)胞的表達(dá);用熒光顯微鏡和激

4、光共聚焦顯微成像技術(shù)確定了TlSP重組蛋白在真核細(xì)胞的分布及亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明重組質(zhì)粒pEGFP-N1-TlSP在Vero細(xì)胞中獲得了表達(dá)，綠色熒光主要聚集于細(xì)胞漿，而在空載體pEGFP-N1轉(zhuǎn)染組，綠色熒光彌散性分布于細(xì)胞核。TlSP融合基因在外源真核Vero細(xì)胞成功進(jìn)行了表達(dá)，表達(dá)蛋白主要定位于Vero細(xì)胞的細(xì)胞漿。
　　以表達(dá)的重組rTlSP作為間接ELISA包被的抗原，建立了檢測羊泰勒蟲抗體的間接ELISA方法。實(shí)驗(yàn)用標(biāo)

5、準(zhǔn)的陰性血清為96份，陽性血清為137份，通過MedCalc Software統(tǒng)計(jì)該方法的敏感性和特異性，確定cut-off值（陰、陽性的臨界值。用該方法驗(yàn)證與巴貝斯蟲的抗體有無交叉反應(yīng)，并檢測了我國部分地區(qū)羊泰勒蟲抗體的高低。研究得出rTlSP抗原的間接ELISA方法cut-off值為19％，特異性達(dá)到97.9％，敏感性達(dá)到97.1％與羊巴貝斯蟲陽性血清無交叉反應(yīng)。該方法的建立為今后應(yīng)用田間檢測羊泰勒蟲建立了血清學(xué)方法，也為本病的進(jìn)一