凡納濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白抗菌降解肽段的鑒定、抑菌活性分析及其相關(guān)降解酶的探索.pdf

1、對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)目前已成為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖中的支柱性產(chǎn)業(yè),但近年來因病害和生物安全等因素給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失。鑒于此,學(xué)者們認(rèn)為“以免疫防治為主,預(yù)防與治療相結(jié)合”的對(duì)蝦健康養(yǎng)殖方法,尤其是開發(fā)尋找替代抗生素的綠色抗菌肽,是解決目前對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展瓶頸的有效途徑之一。有趣的是,近年來研究發(fā)現(xiàn)存在于對(duì)蝦血淋巴中的血藍(lán)蛋白可以產(chǎn)生具有功能性的抗菌降解肽段,但迄今為止,其研究還不夠全面而深入。為此,本研究在此基礎(chǔ)之上,對(duì)凡納濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白降解肽段的種類

2、、抑菌活性及其相關(guān)降解酶等進(jìn)行了較為系統(tǒng)而深入的研究,所獲主要研究結(jié)果如下:
　　1、對(duì)蝦血藍(lán)蛋白抗菌降解肽段的預(yù)測(cè)及其抑菌活性分析
　　采用AntiBPServer、CAMP、APD2等三個(gè)在線軟件預(yù)測(cè)凡納濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白產(chǎn)生抗菌降解肽的可能性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),血藍(lán)蛋白大小亞基有可能產(chǎn)生34個(gè)分子量范圍為1.5-1.9kDa的抗菌肽段,其中12個(gè)肽段由于可能會(huì)形成α螺旋結(jié)構(gòu),且能與病原菌膜相互作用,提示其具有抗菌肽的可能性最大。<

3、br>　　在此基礎(chǔ)之上,進(jìn)一步采用多肽固相化學(xué)方法合成該12條可能性最大的抗菌肽段,并分析其抑菌活性。結(jié)果表明,所合成的12種血藍(lán)蛋白肽段對(duì)革蘭氏陰性菌(副溶血弧菌)和(或)革蘭氏陽性菌(乙型鏈球菌)表現(xiàn)出明顯的抑菌活性,與陰性對(duì)照相比,其抑菌活性大小均在90％以上,其中,S7、S9、B2、B13等四種肽段對(duì)副溶血弧菌和乙型鏈球菌均具有較強(qiáng)抑菌活性,S8、S10、B1、B3、B9、B10、B11、B14等八種肽段僅對(duì)副溶血弧菌具有抑菌活

4、性。由此說明,生物信息學(xué)結(jié)合抑菌實(shí)驗(yàn)策略是研究血藍(lán)蛋白抗菌肽段的一種快速而有效的策略。
　　2、病原菌刺激后對(duì)蝦血藍(lán)蛋白抗菌降解肽段的分離、鑒定與抑菌活性分析
　　首先,采用Tricine-SDS-PAGE、Western-blotting、質(zhì)譜等蛋白質(zhì)組學(xué)方法,分析副溶血弧菌刺激對(duì)蝦后其血漿中產(chǎn)生血藍(lán)蛋白降解肽段的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),副溶血弧菌刺激對(duì)蝦24h后在其血漿中發(fā)現(xiàn)5個(gè)與抗血藍(lán)蛋白抗體呈明顯陽性的小分子肽段。
　

5、　繼而,選取分子量約為6.0kDa的①號(hào)降解肽段進(jìn)行質(zhì)譜分析,結(jié)果顯示,其與凡納濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白(gi|32546253和gi|854403)具有高度同源性。提示,這些小分子肽段應(yīng)為血藍(lán)蛋白的降解肽段。
　　最后,采用平板菌落計(jì)數(shù)方法分析該①號(hào)降解肽段的抑菌活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),其對(duì)副溶血弧菌具有明顯的抑菌活性(抑菌率約為98%),與陰性對(duì)照相比,具有極顯著性差異。
　　由此說明,病原菌刺激后對(duì)蝦血藍(lán)蛋白確實(shí)可以產(chǎn)生不同大小的抗菌肽

6、段。
　　3、與對(duì)蝦血藍(lán)蛋白抗菌降解肽段形成的相關(guān)蛋白酶探索
　　首先,采用ExPASy軟件預(yù)測(cè)可能參與血藍(lán)蛋白降解肽段形成的酶,結(jié)果發(fā)現(xiàn),糜乳蛋白酶(Chymotrypsin)、蛋白酶K(ProteinaseK)、胰蛋白酶(Trypsin)、胃蛋白酶(Pepsin)、熱溶素(Thermolysin)以及內(nèi)肽酶(Endopeptidase)等六種蛋白酶可能與血藍(lán)蛋白降解肽段的形成有關(guān)。
　　其次,采用Substrate

7、-SDS-PAGE酶譜技術(shù)探索對(duì)蝦肝胰腺粗酶液對(duì)血藍(lán)蛋白降解的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),粗酶液中的胰蛋白酶等其它蛋白水解酶可能與血藍(lán)蛋白的降解有關(guān)。
　　最后,運(yùn)用體外胰蛋白酶酶解試驗(yàn)、Tricine-SDS-PAGE以及Western-blotting等技術(shù)進(jìn)一步分析胰蛋白酶對(duì)血藍(lán)蛋白的降解作用。結(jié)果表明,胰蛋白酶可將血藍(lán)蛋白降解成分子量約為5.0～20.0kDa的小分子肽段群,其中3個(gè)肽段與副溶血弧菌刺激后對(duì)蝦血藍(lán)蛋白產(chǎn)生的降解肽段分子