SP和CMP抗PCV2感染的作用和機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、茯苓多糖是從茯苓[poria cocos(Schw.) Wolf]中提取的，具有很強(qiáng)的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性，能提高細(xì)胞介導(dǎo)的免疫活性的一種活性成分，但由于它的水溶性差，限制了其在臨床上的應(yīng)用。經(jīng)過硫酸酯化修飾后得到的硫酸酯化茯苓多糖(Sulfationpachymaran，SP)和經(jīng)羧甲基化得到的羧甲基茯苓多糖(Carboxymethytl pachymaram，CMP)易溶于水，具有抗腫瘤、抗病毒作用以及免疫調(diào)節(jié)的功能更加顯著。而豬圓

2、環(huán)病毒2型(porcine circovirus type2，PCV2)是斷奶后仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（postweaning mutisystenic wasting syndrome，PMWS）的主要病原。該病在世界各地廣泛流行，PMWS患豬淋巴組織中淋巴濾泡內(nèi)B細(xì)胞依賴區(qū)域以及濾泡旁T細(xì)胞依賴區(qū)域的淋巴細(xì)胞減少，從而導(dǎo)致免疫缺陷，使宿主長(zhǎng)期處于免疫抑制狀態(tài)。本研究的目的旨在探討SP和CMP對(duì)PCV2引起仔豬免疫細(xì)胞產(chǎn)生免疫抑制的調(diào)節(jié)

3、作用以及對(duì)PCV2感染小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)及其機(jī)理，為SP和CMP在豬免疫抑制性疾病綜合防治中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 1 SP和CMP對(duì)PCV2感染仔豬脾細(xì)胞的增殖和分泌細(xì)胞因子的影響
　　 篩選豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV）/PCV2抗原和抗體均為陰性的斷奶仔豬，無菌分離脾細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。先加入1000TCID50 PCV

4、2病毒懸液孵育2h后，再加入終濃度分別為400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL和12.5μg/mL的SP/CMP，MTT法測(cè)定豬脾T/B淋巴細(xì)胞體外增殖;ELISA方法檢測(cè)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-2、IL-8、IL-10和TNF-α等細(xì)胞因子。結(jié)果顯示，SP和CMP能協(xié)同ConA/LPS促進(jìn)PCV2感染的豬脾T/B淋巴細(xì)胞體外增殖，提高PCV2感染的豬脾淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答能力。同

5、時(shí)，SP和CMP能顯著促進(jìn)PCV2感染的豬脾細(xì)胞分泌IL-2，濃度為100μg/mL的CMP能下調(diào)PCV2感染仔豬脾細(xì)胞分泌IL-10。濃度為50～200μg/mL的SP能顯著降低PCV2感染的豬脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β水平，同時(shí)可刺激TNF-α的分泌。說明SP和CMP可以通過促進(jìn)豬脾T/B淋巴細(xì)胞增殖活性以及調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌，增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。
　　 2 SP和CMP對(duì)PCV2感染的豬肺泡巨噬細(xì)胞吞噬功

6、能和活性的影響
　　 篩選PRRSV/PCV2抗原和抗體均為陰性的斷奶仔豬，通過支氣管獲取肺泡灌洗液并分離豬肺泡巨噬細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。首先加入1000 TCID50 PCV2病毒懸液孵育2h，再加入終濃度分別為400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL和12.5μg/mL的SP/CMP，分別測(cè)定體外培養(yǎng)的豬肺泡巨噬細(xì)胞吞噬功能和培養(yǎng)上清液NO含量以及IL-1β、IL-8、IL-10、TN

7、F-α和MCP-1等細(xì)胞因子。結(jié)果顯示，SP和CMP能提高PCV2感染的豬肺泡巨噬細(xì)胞吞噬功能。SP在第4h、8h、24h時(shí)能下調(diào)PCV2感染肺泡巨噬細(xì)胞引起NO的過度分泌，CMP在第4h和8h時(shí)能下調(diào)PCV2感染的豬肺泡巨噬細(xì)胞過度分泌的NO水平。同時(shí)，SP和CMP能有效地下調(diào)PCV2感染的肺泡巨噬細(xì)胞過度分泌IL-8和IL-10，并對(duì)IL-1β分泌發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明了SP和CMP通過激活豬肺泡巨噬細(xì)胞吞噬功能以及調(diào)節(jié)NO和細(xì)胞因

8、子的分泌，提高PCV2感染的豬肺泡巨噬細(xì)胞的免疫功能。
　　 3 SP和CMP對(duì)PCV2感染誘導(dǎo)豬脾細(xì)胞氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用
　　 為了探討SP和CMP對(duì)PCV2感染的豬脾細(xì)胞氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用，從PRRSV/PCV2抗原和抗體均為陰性的斷奶仔豬中無菌分離豬脾細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。首先在培養(yǎng)的脾細(xì)胞中加入1000 TCID50PCV2病毒懸液，孵育感染2h后加入終濃度分別為200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、2

9、5μg/mL的SP/CMP，測(cè)定脾細(xì)胞內(nèi)ROS水平以及細(xì)胞培養(yǎng)上清液超氧化物岐化酶(T-SOD)和總抗氧化能力(TAOC)。結(jié)果顯示，SP和CMP能下調(diào)PCV2誘導(dǎo)免疫細(xì)胞產(chǎn)生過量的ROS;同時(shí)能提高感染PCV2的豬脾細(xì)胞T-SOD和TAOC活性。結(jié)果表明，SP和CMP能通過降低PCV2感染豬脾細(xì)胞內(nèi)ROS，升高T-SOD和TAOC的活性來提高細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力，從而保護(hù)免疫細(xì)胞，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。
　　 4 CMP對(duì)PCV2

10、感染小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)
　　 為了研究CMP對(duì)PCV2感染小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用，將體重為18～22g的100只昆明系小鼠隨機(jī)分成5組（A-E組），A、B、C、D組在第1d、3d、5d、7d通過腹腔注射、滴鼻以及口服三種途徑聯(lián)合感染PCV2病毒懸液(1000 TCID50)，0.5mL/只，E組給予相同劑量生理鹽水。在第8d，9d，10d，A、B、C組小鼠給予腹腔注射終濃度分別為200 mg/kg.BW、100 mg/kg.BW和5

11、0 mg/kg.BW的CMP，D和E組給予相同劑量生理鹽水。第11d剖殺各組小鼠，測(cè)定免疫器官指數(shù)、小鼠脾淋巴細(xì)胞的體外增殖活性、脾臟和胸腺組織T-SOD、TAOC和GSH含量;ELISA方法檢測(cè)血清中IL-2、IL-10、IL-6和IFN-α含量;用熒光定量PCR方法檢測(cè)脾臟和胸腺組織IL-2、IL-10mRNA表達(dá)量。結(jié)果顯示，CMP能顯著升高PCV2感染小鼠的脾臟和胸腺指數(shù)以及促進(jìn)T或B淋巴細(xì)胞體外增殖，提高脾臟和胸腺組織的TSO