禽致病性大腸桿菌O2-K1菌株IMT5155基因組特征及DE205B株黏附素和轉(zhuǎn)錄因子的功能研究.pdf

1、禽致病性大腸桿菌(Avian Pathogenic Escherichia coli，APEC)是一類(lèi)典型的腸道外致病性大腸桿菌(Extraintestinal Pathogenic E.coli，ExPEC)，APEC通過(guò)呼吸道感染禽類(lèi)，在呼吸道和肺組織定殖，強(qiáng)毒株能引起肺組織的嚴(yán)重病變和炎癥反應(yīng)，包括氣囊炎和肺炎，強(qiáng)毒株可以突破肺臟的免疫防御進(jìn)入血液，進(jìn)而引起敗血癥和多系統(tǒng)混合感染。禽大腸桿菌病(Avian Colibacillos

2、is)是危害養(yǎng)禽業(yè)的細(xì)菌性傳染病之一，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失，由于當(dāng)前研究成果不能全面揭示APEC感染禽宿主的致病機(jī)制，并且APEC具有血清型多樣性特征，目前沒(méi)有有效防控APEC感染禽宿主的疫苗。本文對(duì)APEC O2∶K1血清型菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序，通過(guò)比較基因組分析鑒定APEC基因組特征，對(duì)APEC流行毒株進(jìn)行致病力評(píng)價(jià)，篩選和鑒定APEC新的毒力因子和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，研究結(jié)果豐富了對(duì)禽致病性大腸桿菌致病機(jī)制的認(rèn)識(shí)。
　　1.APE

3、C O2∶K1血清型菌株IMT5155全基因測(cè)序及比較基因組學(xué)研究
　　本研究首次對(duì)APEC O2∶K1血清型毒株IMT5155進(jìn)行全基因測(cè)序，進(jìn)行比較基因組學(xué)研究，分析IMT5155演化關(guān)系和基因藍(lán)圖，結(jié)果表明IMT5155與典型的ExPEC強(qiáng)毒株具有相近的演化關(guān)系;通過(guò)對(duì)IMT5155基因組的毒力島分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)APECO2∶K1血清型菌株特有的基因島，這個(gè)新的基因島命名為PAI I5155(GI-12);另外，兩個(gè)六型分泌

4、系統(tǒng)(T6SSs)分別位于IMT5155的基因島GI-7和GI-16，并且普遍同時(shí)存在于ExPEC O1、O2和O18優(yōu)勢(shì)血清型菌株;IMT5155含有兩個(gè)質(zhì)粒，其中大質(zhì)粒p1ColV5155含有多類(lèi)毒力因子，其影響APEC的致病力;對(duì)B2 ExPEC泛基因組中毒力因子進(jìn)行分類(lèi)和基因分布分析，結(jié)果表明B2群ExPEC強(qiáng)毒株基因組中部分類(lèi)型的毒力因子為APEC/ExPEC特有的毒力因子，比如黏附素、侵襲素、毒素和涉鐵系統(tǒng)等;通過(guò)4種動(dòng)物模

5、型對(duì)APEC O1∶K1和O2∶K1血清型菌株（中國(guó)分離株）進(jìn)行致病力測(cè)定，結(jié)果表明這些菌株屬于強(qiáng)毒株，能引起較強(qiáng)的禽大腸桿菌病，并且能引起大鼠乳鼠的腦膜炎，表明APEC O1∶K1和O2∶K1菌株可能具有人畜共患潛力。
　　2.APEC自分泌黏附素AatB的鑒定和功能分析
　　通過(guò)比較分析APEC基因組發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的APEC自分泌黏附素基因aatB，其堿基序列長(zhǎng)度為1017bp，編碼一個(gè)36.3kDa的蛋白，對(duì)AatB結(jié)構(gòu)

6、預(yù)測(cè)分析證實(shí)其具有典型的AT結(jié)構(gòu)域，包含N端信號(hào)肽、膜外功能域和C端β折疊跨膜域，基因分布檢測(cè)表明aatB在APEC分離株分布率為26.4％(72/273)，而aatB基因在ECOR D和B2群APEC菌株中分布率較高（接近70％）。本研究構(gòu)建DE205B aatB的缺失株和互補(bǔ)株，實(shí)驗(yàn)證實(shí)aatB的缺失會(huì)降低DE205B對(duì)DF-1細(xì)胞的黏附能力和對(duì)雛鴨的致病力(LD50)，并且降低DE205B在雛鴨肺臟內(nèi)的定殖能力，而aatB互補(bǔ)株的

7、致病力基本恢復(fù)至野生株水平，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)AatB與APEC的致病力有直接相關(guān)性，AatB能夠影響APEC對(duì)宿主細(xì)胞的黏附定殖，并且Western blot證實(shí)AatB可以激發(fā)雛鴨產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的抗體。另外，生物被膜實(shí)驗(yàn)證實(shí)AatB能夠介導(dǎo)無(wú)FI菌毛E.coli AAEC189生物被膜的形成能力。
　　3.APEC自分泌黏附素UapB的鑒定和功能分析
　　APEC強(qiáng)毒株DE205B編碼一個(gè)典型的傳統(tǒng)AT蛋白UpaB，本研究對(duì)該蛋

8、白進(jìn)行功能鑒定，并構(gòu)建APEC強(qiáng)毒株DE205B的upaB基因缺失株，結(jié)合前期對(duì)APEC ATs(AatA和AatB)致病力的研究，構(gòu)建了基因upaB、aatA和aatB的雙缺失和三缺失菌株。PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)upaB基因在APEC菌株中的分布率為41.9％，并且主要分布于ECOR B2和D群（分布率～70％）;黏附試驗(yàn)證實(shí)UpaB介導(dǎo)DE205B對(duì)DF-1 cells的黏附，并且UpaB能提高無(wú)菌毛菌株AAEC189的凝集和形成生物被膜的

9、能力;與野生株DE205B相比，upaB、aatA和aatB雙缺失或三缺失菌株顯著降低其對(duì)DF-1細(xì)胞的黏附能力和對(duì)雛鴨早期感染時(shí)在肺臟內(nèi)定殖的能力，伴隨著半數(shù)致死劑量(LD50)的上升;在DE205B△upaB/△aatA/△aatB早期感染階段，RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該菌株的菌毛黏附素基因(yqiL和yadN)及空泡形成毒素基因vat（編碼AT家族蛋白）的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于在體外LB培養(yǎng)時(shí)，因此推測(cè)在感染過(guò)程三缺失菌株DE205B△up

10、aB/△aatA/△aatB試圖通過(guò)上調(diào)毒力因子(YqiL、YadN和Vat)的表達(dá)水平以補(bǔ)償其致病力;實(shí)驗(yàn)證實(shí)UapB、AatA和AatB均具有免疫原性，疫苗接種相關(guān)蛋白對(duì)雛鴨具有一定程度上的免疫保護(hù)力，因而ATs(UapB、AatA和AatB)可以作為APEC亞單位疫苗的候選對(duì)象。
　　4.轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子AutA/AutR調(diào)控禽致病性大腸桿菌感染的分子機(jī)制
　　禽致病性大腸桿菌(APEC)通過(guò)呼吸系統(tǒng)感染禽類(lèi)宿主，APEC

11、可以迅速地調(diào)整毒力相關(guān)因子的表達(dá)模式以促進(jìn)對(duì)宿主的感染定殖，在這個(gè)感染過(guò)程中需要特定的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子參與APEC毒力因子表達(dá)調(diào)控。這些受調(diào)節(jié)的毒力因子包含自分泌黏附素和K1莢膜，這兩種毒力因子促進(jìn)APEC黏附定殖于宿主的巨噬/非巨噬細(xì)胞，及利于APEC耐受血清殺菌作用。本研究發(fā)現(xiàn)并命名了兩個(gè)新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子AutA和AutR，基因aurA和autR位于DE205B基因組的UpaB基因簇，基因分布檢測(cè)證實(shí)UpaB基因簇主要APEC B2

12、和D群分離株。RT-PCR和β半乳糖苷酶試驗(yàn)證實(shí)AutA和AutR共同調(diào)控DE205B黏附素UpaB的表達(dá)，電泳遷移分析和體外轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)證實(shí)AutA和AutR可以直接與upaB啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，AutA可以激活upaB轉(zhuǎn)錄，而AutR通過(guò)阻礙AutA的活性來(lái)抑制upaB轉(zhuǎn)錄。不僅如此，轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)AutA和AutR共同調(diào)節(jié)APEC一百多個(gè)基因的mRNA轉(zhuǎn)錄，受調(diào)控的基因表達(dá)產(chǎn)物包括黏附素、K1莢膜和酸耐受系統(tǒng)等。進(jìn)一步研究表明，在APEC