水稻ORF216蛋白和煙草SM-NGT1蛋白的原核表達研究.pdf

1、植物細胞質(zhì)雄性不育(Cytoplasmic male sterility，CMS)是指植物雄性器官喪失功能，而雌性器官發(fā)育正常，表現(xiàn)為母性遺傳的生物學現(xiàn)象。根據(jù)恢、保關(guān)系，水稻CMS可分為野敗(wild abortive，WA)型、包臺(Chinsurah Boro II，BT)型和紅蓮(Honglian，HL)型三種主要類型。
　　 由糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferases，GTs)催化的糖基化反應(yīng)在原核和真核生

2、物中都有著重要的生物學功能。GTs能將有活性的供體(通常是二磷酸核苷-糖)的單糖部分轉(zhuǎn)移至受體上，受體可以是糖、脂類、蛋白質(zhì)和核酸等。GTs在植物中多個方面起著關(guān)鍵的作用，比如調(diào)節(jié)代謝、調(diào)節(jié)激素活性水平、解毒、參與細胞壁合成等。
　　 在本實驗室已克隆了一個HL-CMS相關(guān)基因orf216和煙草糖基轉(zhuǎn)移酶基因sm-Ngt1的基礎(chǔ)上，本研究將這兩個目的基因克隆入原核表達載體進行高效表達，目的蛋白純化后制備多克隆抗體。通過Weste

3、rn blot檢測分析水稻和煙草植株中兩個基因的表達。取得了以下研究結(jié)果。
　　 1.設(shè)計特異性PCR引物，通過PCR擴增得到orf216基因。將該基因克隆入含有內(nèi)含肽標簽的原核表達載體pTYB1中，得到重組質(zhì)粒pTYB1-orf216，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌ER2566感受態(tài)細胞。為了高效表達orf216基因，進行誘導(dǎo)表達條件的優(yōu)化，結(jié)果確定15 ℃ 0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)15 h為蛋白誘導(dǎo)表達的優(yōu)選條件。通過S

4、DS-PAGE分析，在可溶性組分中檢測到約85 kD的目的蛋白條帶。目的蛋白采用親和層析分離純化，經(jīng)N-端質(zhì)譜鑒定后制備多克隆抗體。Western blot檢測水稻組織中蛋白的表達，表明多克隆抗體具有較高的特異性。
　　 2.設(shè)計特異性PCR引物，通過PCR擴增得到sm-Ngt1基因。將該基因分別克隆入含有6×his標簽的原核表達載體pET-30a、含有內(nèi)含肽標簽的原核表達載體pTYB1和含有GST標簽的原核表達載體pGEX-6

5、P-1中，得到重組質(zhì)粒pET-smNgt1、pTYB1-smNgt1和pGEX-smNgt1，將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21、ER2566和BL21感受態(tài)細胞。進行誘導(dǎo)表達條件的優(yōu)化，結(jié)果確定15 ℃下0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)20 h為pET-smNgt1誘導(dǎo)表達的優(yōu)選條件，15 ℃下0.3 mmol/L IPTG誘導(dǎo)15 h為pTYB1-smNgt1誘導(dǎo)表達的優(yōu)選條件，37 ℃下0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)3 h