乙烯響應(yīng)因子家族基因MdERF98的表達(dá)載體構(gòu)建、蘋果細(xì)胞轉(zhuǎn)化與功能初步鑒定.pdf

1、乙烯是一重要植物激素，而在蘋果這一以果實(shí)發(fā)育為重要研究對(duì)象的植物中，它的地位和作用又尤為重要和特殊，因?yàn)樗{(diào)控果實(shí)的成熟；同時(shí)，乙烯又是植物抗病抗逆過程中重要的信號(hào)分子。
　　乙烯響應(yīng)因子（Ethylene responsive factor，ERF）基因是植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抗性以及對(duì)乙烯等植物抗性相關(guān)激素的應(yīng)答。我們實(shí)驗(yàn)室的前期研究結(jié)果表明，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族中一轉(zhuǎn)錄因子MdERF98的表達(dá)能

2、夠被蘋果輪紋病菌侵染所特異性誘導(dǎo)表達(dá)（張芮，2015），而該基因的功能以及在抗病抗逆中的作用，仍屬未知，這引起我們強(qiáng)烈的興趣。因此，在本研究中，首先應(yīng)用生物信息學(xué)的方法，對(duì)該基因所屬的蘋果ERF基因家族的282個(gè)成員進(jìn)行了生物信息學(xué)與進(jìn)化樹聚類分析；其次，克隆構(gòu)建了MdERF98二元表達(dá)載體，進(jìn)行了蘋果愈傷組織細(xì)胞轉(zhuǎn)化，成功獲得超表達(dá)MdERF98轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株，對(duì)該轉(zhuǎn)基因在抗鹽中的作用進(jìn)行了研究。
　　主要研究結(jié)果如下：
　

3、　1.生物信息學(xué)與進(jìn)化樹分析表明：MdERF98與蘋果基因組中MDP0000286915、MDP0000187369、MDP0000880063、MDP0000155543、MDP0000133854具有較高同源性，在進(jìn)化樹中，聚為一類，該類轉(zhuǎn)錄因子家族基因功能未知。同時(shí)，與在抗病反應(yīng)中具有重要作用的經(jīng)典的AP2轉(zhuǎn)錄因子家族基因Pti4沒有聚為一類，相似性較低，同源關(guān)系較遠(yuǎn)。
　　2.從蘋果愈傷組織細(xì)胞中提取RNA，以反轉(zhuǎn)錄得到的

4、cDNA為模板，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到MdERF98目的基因，將目的基因片段鏈接至中間載體pHBT上，用NcoI和PstI雙酶切獲得目的基因片段，將目的基因成功連接至二元表達(dá)載體pCB302上，然后將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)一步用含有目的基因的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞侵染野生型蘋果‘王林’愈傷組織，獲得轉(zhuǎn)化MdERF98基因的‘王林’愈傷組織。
　　3.分別對(duì)超表達(dá)MdERF98的蘋果愈傷組織（王林）與野生型愈傷組織（王林）進(jìn)行

5、鹽脅迫處理，共設(shè)置0 mM、25 mM、50 mM、100 mM、150 mM和200 mM六個(gè)NaCl的濃度梯度。結(jié)果表明：隨著NaCl濃度的升高，愈傷組織的細(xì)胞生長(zhǎng)量顯著下降，但是，在鹽分脅迫下，超表達(dá)MdERF98的轉(zhuǎn)基因王林細(xì)胞的生長(zhǎng)量顯著高于野生型， MdERF98超表達(dá)顯著提高了對(duì)鹽分脅迫的抗性。
　　4.與以擬南芥為研究試材的研究結(jié)果不同，在蘋果中超表達(dá)MdERF98，沒有顯著提高維生素C的含量。推測(cè)，在蘋果細(xì)胞中，