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1、<p> Notch3在乳腺組織中的表達(dá)以及與乳腺癌癌變進(jìn)展的關(guān)系</p><p> 摘要:目的 檢測(cè)乳腺組織中Notch3的蛋白表達(dá)水平,以及分析其與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)了Notch3在癌旁正常乳腺組織和乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)水平,并且運(yùn)用統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)一步分析了Notch3表達(dá)水平和乳腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果 Notch3的蛋白水平在乳腺癌組織中
2、顯著高于癌旁正常乳腺組織,P=0.000;Notch3的蛋白高表達(dá)和乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),P=0.000,在TNM各分期中差異明顯,和更高的分期呈正相關(guān),P=0.004;在病理學(xué)分級(jí)中差異明顯,和更高的分級(jí)呈正相關(guān),P=0.035。結(jié)論 Notch3的高表達(dá)可能存進(jìn)乳腺癌的癌變和進(jìn)展。 </p><p> 關(guān)鍵詞:Notch3;Notch信號(hào)通路;乳腺癌 </p><p> 乳
3、腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,也是威脅女性健康的主要原因之一,雖然隨著診斷及先進(jìn)治療手段的普及,乳腺癌的預(yù)后已經(jīng)較之前有了很大提升,但是乳腺癌整體的防治還亟需繼續(xù)探尋[1]。而近年來(lái),研究乳腺癌的分子診斷標(biāo)記物和分子靶向治療成為一個(gè)重點(diǎn)趨勢(shì)。 </p><p> Notch3是Notch受體家族中的一員,其位于19q12 染色體上,由 33 個(gè)外顯子組成,編碼1個(gè)由2321個(gè)氨基酸組成的跨膜蛋白受體,和家族其
4、它成員相似,也是由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三部分組成,在和Notch家族配體結(jié)合后,激活Notch信號(hào)通路,進(jìn)而發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、增殖和凋亡以及維持干細(xì)胞的作用[2]。進(jìn)來(lái)研究發(fā)現(xiàn)包括Notch3在內(nèi)的Notch信號(hào)通路的激活以及其活性分子的活化可以促進(jìn)肝細(xì)胞癌[3]、結(jié)腸癌[4]和卵巢癌[5]等腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展,特別是Hu C和Chen CF發(fā)現(xiàn)在乳腺癌小鼠模型和細(xì)胞株中,Notch3的過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生和進(jìn)展[6-7]。于
5、是本課題組設(shè)想在乳腺癌人組織中驗(yàn)證上述發(fā)現(xiàn)。 </p><p><b> 1資料與方法 </b></p><p> 1.1一般資料 收集2006年~2014年石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科被診斷為乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(IDC)的石蠟包埋組織標(biāo)本,共計(jì)90例,均為女性,年齡30~72歲,中位年齡55歲,平均年齡50歲,同時(shí)收集對(duì)照癌旁正常乳腺組織30例。所有樣本均由
6、本科室2名高年資病理學(xué)醫(yī)師對(duì)HE染色切片進(jìn)行組織學(xué)觀察和復(fù)查診斷,并進(jìn)行分型、分級(jí),其中TNM分期,0~Ⅰ期20例,Ⅱ期35例,Ⅲ期35例;病理學(xué)分級(jí),高分化(Ⅰ級(jí))乳腺癌13例,中分化(Ⅱ級(jí))乳腺癌50例,低分化(Ⅲ級(jí))乳腺癌27例。 </p><p> 1.2試劑 中性福爾馬林固定液、乙醇、二甲苯、枸櫞酸鹽、Z中性樹(shù)膠、DAB顯色液、H2O2均為國(guó)產(chǎn)產(chǎn)品。EnVision試劑盒購(gòu)自于丹麥Dako公司,Not
7、ch3抗體購(gòu)自abcam公司,克隆號(hào)為ab60087,抗體來(lái)源兔抗人,稀釋濃度為1:200。 </p><p> 1.3免疫組化染色 免疫組化采用Envision法。將烤好的切片依次輕放入二甲苯I、II、III中;然后將脫蠟后的切片按順序浸入裝有梯度乙醇溶液的液缸中;采用微波修復(fù)方法,將修復(fù)完的切片浸入新配制的3%甲醇雙氧水溶液中,室溫放置10min,然后用自來(lái)水沖洗1~2次;每張切片滴加已稀釋至最佳工作濃度的
8、一抗各160μl,放入4℃冰箱過(guò)夜,孵育;將過(guò)夜后的切片從4℃冰箱取出,室溫放置10min;每張切片均滴加二抗各160μl,放入37℃恒溫箱,孵育30min;每張切片滴加1~2滴新配制的DAB顯色液,顯微鏡下觀察組織顯色情況;顯色完成后迅速用自來(lái)水沖洗,放入蘇木素中復(fù)染2.5min,鹽酸酒精分化4~6s,然后自來(lái)水中返藍(lán)3min;切片再次脫水、透明,中性樹(shù)膠封片。 </p><p> 1.4免疫組化結(jié)果評(píng)定 N
9、otch3染色后出現(xiàn)細(xì)胞漿和/胞膜出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞,隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(×400),每個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,參照許良中[8]等的方法, 再結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn),將切片中陽(yáng)性細(xì)胞所占觀察細(xì)胞數(shù)的百分比≤10%計(jì)1分,11%~50%計(jì)2分,51%~75%計(jì)3分,76%~100%計(jì)4分;著色強(qiáng)度無(wú)著色計(jì)0分,淡黃色計(jì)1分,棕黃色計(jì)2分,棕褐色計(jì)3分,由兩項(xiàng)積分相加進(jìn)行評(píng)分;0~5分評(píng)為陰性表達(dá)(-),>
10、;6分評(píng)為陽(yáng)性表達(dá)(+)。 </p><p> 1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 17. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)數(shù)資料采用四格表或列聯(lián)表χ2檢驗(yàn)法,以α=0.05雙側(cè)檢驗(yàn)為檢驗(yàn)顯著性水準(zhǔn),P<0.05表示差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 </p><p><b> 2 結(jié)果 </b></p><p> 2.1 Notch3蛋白在癌旁正常乳腺和乳腺
11、浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的表達(dá) </p><p> 結(jié)果如圖1所示,Notch3蛋白表達(dá)定位于乳腺癌癌細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞膜,染色顏色多為棕黃色和棕褐色,陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比多為>51%;而在癌旁正常乳腺組織中多無(wú)著色或淡黃色,陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比多<51%。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)結(jié)果見(jiàn)表1所示,Notch3蛋白在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(IDC)和癌旁正常乳腺組織(ANBT)中陽(yáng)性表達(dá)率分別為52.3%(47/90)和6.7%(2/30
12、),采用χ2 檢驗(yàn)比較顯示,二者表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。 </p><p> 圖 1 Notch3蛋白在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(IDC)和癌旁正常乳腺(ANBT)的表達(dá)(EnVision×200 1:200) </p><p> 2.2 Notch3蛋白表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 結(jié)果如表2所示,在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性(-)和陽(yáng)性(+)的患者中,Notch3蛋白表
13、達(dá)率分別為18%(5/28)和68%(42/62),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000);在0-I、II和III期的患者中,Notch3蛋白表達(dá)率分別為25%(5/28)、49%(17/35)和71%(25/35),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004);在I、II和III級(jí)的患者中,Notch3蛋白表達(dá)率分別為23%(3/13)、52%(26/50)和67%(18/27),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.035)。 3 討論 </p&
14、gt;<p> Notch信號(hào)通路的激活與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系,Notch 通路中有5種Notch 配體,包括Jagged1、Jagged2、Delta1、Delta3和Delta4,4種受體,包括Notch1、Notch2、Notch3和Notch4。本實(shí)驗(yàn)組前期研究結(jié)果表明,Notch信號(hào)通路分子中的Notch1蛋白[9]、N1IC蛋白[10]和Snail蛋白[11]高表達(dá)分別與乳腺癌變、侵襲轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),
15、說(shuō)明三者可能促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。課題組前期也在乳腺組織中檢測(cè)了Notch1、N1IC及Snail蛋白表達(dá),得出結(jié)論與文獻(xiàn)結(jié)果一致。而除了Notch1,Notch3也被報(bào)道其高表達(dá)可能導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生[6-7],并且預(yù)示著乳腺癌患者有著不佳的預(yù)后[12],而這一些列促乳腺癌癌變的過(guò)程可能與Her-2、ER通路有關(guān),抑制 Notch3信號(hào)通路可能是靶向治療乳腺癌的一個(gè)新的方向[13]。 </p><p>
16、本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Notch3蛋白在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中明顯高于癌旁正常乳腺組織,闡明高Notch3表達(dá)可能促進(jìn)乳腺癌的癌變,這也和前期在小鼠和乳腺癌細(xì)胞株中Notch3的研究相符[6-7],Notch3信號(hào)通路的異常參與了乳腺癌的癌變進(jìn)展。接著我們?cè)诜治鯪otch3表達(dá)和乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn),Notch3的高表達(dá)和乳腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、更高的TNM分期和較差的分化分級(jí)呈正相關(guān),提示Notch3的高表達(dá)和更差預(yù)后及惡性
17、程度更高的乳腺癌聯(lián)系緊密,而且可能促進(jìn)了乳腺癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。而且近期有研究揭示,Notch3的高表達(dá)和結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及更高的臨床分期呈正相關(guān),在低分化卵巢癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血行轉(zhuǎn)移的卵巢癌中Notch3更易發(fā)現(xiàn)高表達(dá)。這些和我們的發(fā)現(xiàn)都進(jìn)一步提示我們,Notch3可能參與促進(jìn)乳腺癌的癌變和進(jìn)展,Notch3表達(dá)水平有可能作為預(yù)測(cè)癌癥侵襲轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)和對(duì)預(yù)后判斷具有一定價(jià)值。 </p><p> 當(dāng)然,本次實(shí)
18、驗(yàn)仍存在著種種不足之處。首先,更多的樣本量需要被添加在今后的進(jìn)一步研究中,其次,在乳腺組織中除了檢測(cè)Notch3蛋白水平外,我們還可以在用RT-PCR方法檢測(cè)Notch3的mRNA水平,最后,當(dāng)前估算患者預(yù)后較精確的有總生存率和無(wú)病生存率,我們可以隨訪實(shí)驗(yàn)納入的乳腺癌患者的生存資料,進(jìn)行進(jìn)一步的生存分析。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果給予我們后續(xù)研究提供了一個(gè)基礎(chǔ),也為Notch3可能作為一個(gè)潛在的乳腺癌診斷分子標(biāo)記物和靶向治療藥物提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
19、 </p><p><b> 參考文獻(xiàn): </b></p><p> [1]Hong W, Dong E. The past, present and future of?breast cancer?research in China[J].Cancer Lett,2014,351(1):1-5. </p><p> [2]陳春發(fā),豆曉偉
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