8.人參、藜蘆合用對大鼠肝p450酶活性及mrna表達(dá)的調(diào)控作用040930

1、第1頁共7頁KSBIONO.0404《中國中藥雜志中國中藥雜志》367頁人參、藜蘆合用對大鼠肝人參、藜蘆合用對大鼠肝P450酶活性及酶活性及mRNA表達(dá)的調(diào)控作表達(dá)的調(diào)控作用王宇光，高月，柴彪新，陳鵬，譚洪玲，趙永紅，肖成榮，孫圓媛，朱力軍(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所藥理毒理研究室，北京100850)[摘要]目的：研究中藥十八反中人參與藜蘆合用對P450同工酶在酶活性及mRNA水平的調(diào)控作用。方法：采用紫外分光光度法測定大鼠肝微粒體細(xì)

2、胞色素P450與細(xì)胞色素b5含量及氨基比林N脫甲基酶(APND)、對硝基苯酚羥化酶(pNPH)活性。采用RTPCR技術(shù)檢測大鼠肝中5種P450同工酶CYPlAl，CYP2B12CYP2C11，CYP2El及CYP3A1mRNA的表達(dá)。結(jié)果：人參與藜蘆合用可明顯降低P450蛋白含量，可降低細(xì)胞色素b5的含量，單藥及其與藜蘆配伍都能使APND活性下降。在mRNA水平上，藜蘆可誘導(dǎo)CYP2C11的基因表達(dá)，與人參合用后卻使得CYP2C11的表

3、達(dá)下降。藜蘆與人參配伍誘導(dǎo)了CYPlAl的表達(dá)。人參可抑制CYP2B12的基因表達(dá)，與藜蘆合用后卻明顯誘導(dǎo)了CYP2B12的表達(dá)，人參與藜蘆合用后也明顯誘導(dǎo)了CYP3A1的表達(dá)。結(jié)論：人參與藜蘆配伍前后對一些CYP亞型調(diào)控作用發(fā)生明顯變化，可能存在基于藥物代謝酶機(jī)理的相反作用，需進(jìn)一步結(jié)合代謝研究加以綜合分析，闡明相反作用的機(jī)理。[關(guān)鍵詞]十八反；細(xì)胞色素P450；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；藥物相互作用[中圖分類號]R285.5[文獻(xiàn)標(biāo)識碼

4、]A[文章編號]10015302(2004)04—036605細(xì)胞色素P450(cytochromeP450)氧化酶系統(tǒng)是對許多內(nèi)源性和外源性物質(zhì)進(jìn)行I相氧化代謝的主要酶類[1]，其主要位于肝臟中。許多外源性物質(zhì)包括治療藥物、環(huán)境化合物及一些天然產(chǎn)物都能對細(xì)胞色素P450酶系統(tǒng)產(chǎn)生誘導(dǎo)或抑制效應(yīng)，這種對于細(xì)胞色素P450催化的氧化反應(yīng)的調(diào)控作用可以改變許多化合物的藥理或毒理活性[2]。中藥十八反是中藥藥性理論的重要組成部分，是中藥七情“

5、相反”這一配伍的具體體現(xiàn)[3]。人參與藜蘆屬中藥十八反中相反藥對，屬中藥配伍禁忌。反的作用主要是指兩種中藥配伍應(yīng)用產(chǎn)生毒性或使藥效降低。近年來研究發(fā)現(xiàn)，很多中草藥如葛根[4]、梔子[5]、甘草[6]、黃芩[7]等及其單體化合物黃芩苷、梔子苷、甘草甜素都對P450酶有調(diào)控作用，說明中藥對P450酶作用是一種客觀存在。研究人參與藜蘆配伍應(yīng)用對主要的藥物代謝相關(guān)的CYP同工酶的酶活性及mRNA表達(dá)的影響，為進(jìn)一步探討十八反作用的機(jī)理及可能產(chǎn)生

6、的藥物相互作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料與方法1.1藥品與試劑人參購自北京同仁堂中藥廠，藜蘆購自河北安國中藥材市場，均經(jīng)本所馬百平教授鑒定分別為五加科植物人參PanaxgingsengCAMey.的干燥根；百合科植物黑藜蘆VeratrumnigrumL.的干燥根。人參稱重后加入10倍量水，浸泡90min后煎煮3次，每次1h，提取液合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮藥物濃度為100gL1；藜蘆水煎液制備同上，藥物濃度為10gLl；人參藜蘆混合煎液按《中國藥第3

7、頁共7頁酶0.125μL，特異性引物正義鏈和反義鏈各3μL，RNasefreeH2O14.325μL，使反應(yīng)終體積為25μL。用以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：起始變性94℃，30min；循環(huán)時(shí)94℃，30s，56℃，1min，72℃，1min，進(jìn)行23輪循環(huán)最后延伸72℃，8min，將CYPlAl，CYP2B12，CYP2C11，CYP2E1，CYP3A1及CYC(管家基因，作為內(nèi)參照)等體積的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μL上樣，經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠

8、電泳辨認(rèn)，拍照，檢測時(shí)以CYC基因的RTPCR產(chǎn)物為內(nèi)參照，計(jì)算CYPlAl，CYP2B12，CYP2Cll，CYP2E1及CYP3A12基因與CYC基因擴(kuò)增條帶表達(dá)量像素灰度的比值作為P450亞酶mRNA表達(dá)的相對水平。特異性引物序列見表1。表1用于半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)分析的大鼠P450亞酶引物序列P450同工酶5‘正義鏈引物3‘反義鏈引物片段長度bpCYP1A1CTGGTTCTGGATACCCAGCTGCCTAGGGTTGGTT

9、ACCAGG331CYP2B12GAGTTCTTCTCTGGGTTCTGACTGTGGGTCATGGAGAGCTG549CYP2C11CTGCTGCTGCTGAAACACGTGGGATGACAGCGTACTATCAC248CYP2E1CTCCTCGTCATATCCATCTGGCAGCCAATCAGAAATGTGG473CYP3A1ATCCGATATGGAGATCACGAAGAAGTCCTTGTCTGC579CYCCTTCGACATCAC

10、GGCTGATGGCAGGACCTGTATGCTTCAGG2651.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用s表示，采用SAS軟件兩因素析因設(shè)計(jì)的方差分析進(jìn)行組x間比較。2結(jié)果2.1單藥及配伍應(yīng)用對大鼠肝細(xì)胞色素P450及細(xì)胞色素b5含量的影響表2可見，在臨床用藥劑量并且連續(xù)給藥7d后，藜蘆組P450含量與對照組比較無顯著性差異(P0.05)，人參組與對照組比較P450含量明顯下降(P0.05)，而與藜蘆配伍后使細(xì)胞色素b5含量均明顯下降。藜蘆人參組與對照