干細胞治療

1、東北師范大學,干細胞工程與治療,東北師范大學,細胞核移植（續(xù)）,東北師范大學,東北師范大學,核移植受體細胞質的準備,受體胞質主要有三類；MⅡ期卵母細胞，合子期受精卵和2細胞期胚胎，以MⅡ期卵母細胞最為常用。因MⅡ期卵母細胞核、質均已發(fā)育成熟，含有足量的促使移植核再分化所必需的各種核重編程因子，不僅是最適合的體外受精配子，也是最適合的體細胞核移植受體。,東北師范大學,東北師范大學,減數分裂,MⅡ,東北師范大學,東北師范大學,MⅡ期卵母細

2、胞,MⅡ期卵母細胞含高水平細胞促成熟因子(MPF)，能啟動細胞周期由G2向M期轉變，導致核膜消失、染色體集縮、紡錘體形成等，這些正是供體核發(fā)生、發(fā)育程序重編所必需的形態(tài)變化。MⅡ期卵母細胞的第二極體易于觀察，因為染色體位于第二極體附近，甚至有通道連接，便于染 色體定位于去核操作,東北師范大學,東北師范大學,普通注射針與壓電針的比較,東北師范大學,卵母細胞的去核,吸核法：細胞置于含有細胞松弛素的培養(yǎng)液中，破壞細胞骨架，增加膜流動性，

3、去核后細胞膜仍保持完整。用去核針穿過透明帶，將染色體吸出。完全去核是核移植能否成功的關鍵，遺傳物質殘留會阻礙重組胚發(fā)育。,東北師范大學,東北師范大學,卵母細胞的去核-化學誘導去核,用秋水仙胺處理激活的MⅡ早期卵母細胞，促排第二極體，由于藥物作用使MⅡ染色體不能分離，進而全部進入第二極體，達到去核目的。此法易于操作，可一次性處理大量卵母細胞。,東北師范大學,東北師范大學,重組胚的構建-電融合法,先將供體細胞核注射到卵母細胞的卵周隙內，

4、形成供體核卵母細胞復合體。在電場脈沖的作用下膜表面形成微孔進而融合。融合條件隨溶液、設備及細胞不同而改變，需進行摸索。以將要引起細胞發(fā)生溶解的脈沖強度為最佳融合電參數。,東北師范大學,東北師范大學,重組胚的構建-核注射法,通過顯微注射將細胞核直接注入卵母細胞質。注射前需用較小針頭反復抽吸供體細胞核，使其充分去掉細胞質。適合細胞核較小，電融合比較困難的核移植。,東北師范大學,東北師范大學,重組胚的激活,由于缺少受精步驟，重組胚必須

5、進行人工激活后才能進一步發(fā)育。瞬間性鈣震蕩是精子入卵后引起激活及胚胎發(fā)育的基礎。震蕩頻率、振幅及持續(xù)時間都將影響胚胎發(fā)育。凡能引起鈣震蕩的方法都能激活卵母細胞及核移植胚胎。,東北師范大學,東北師范大學,受精瞬間觸發(fā)的卵細胞鈣震蕩(calcium wave),東北師范大學,東北師范大學,重組胚孤雌激活的常用方法,電激活:高壓直流脈沖形成瞬間微孔，鈣離子進入，卵母細胞激活，多次脈動可提高激活率。乙醇激活：8%乙醇處理細胞5分鐘，啟動

6、膜IP3形成，介導鈣庫釋放鈣離子。鍶離子激活：與鈣同屬二價陽離子，能夠進入細胞內鈣庫，能夠在一定時間內引起波動性鈣離子釋放，與正常受精過程中瞬時性鈣震蕩十分相似。,東北師范大學,東北師范大學,抑制重組胚第二極體排放,抑制第二極體排放—MⅡ細胞具有向單倍體卵細胞分裂的傾向，即便是核置換后也如此，必須阻止第二極體排放而再次形成卵子，使其發(fā)育成向囊胚。加入二甲氨基嘌呤(6-DMAP)可抑制抑制成熟促進因子（MPF）活性，阻止卵母細胞成熟分

7、裂，維持二倍體狀態(tài)，利于移植核的去分化及重編程。,東北師范大學,東北師范大學,供體細胞核與受體細胞質相互作用,G1期核早期移入后凝集成單個染色體叢，只形成一個原核，不形成極體。G1晚期核移入后易形成多個染色體叢，形成一個原核外，常排出多個極體，導致重組胚染色體異常。S期更是如此。供體細胞在移核前要用0.5%血清的培養(yǎng)基進行適度饑餓培養(yǎng)，迫使細胞停滯在G1期，有利于與受體細胞質的協(xié)調性。接觸抑制的細胞也常為G1期。,東北師范大學,東北

8、師范大學,供體細胞類型與供體細胞周期相,分化程度低越有利于程序重編，發(fā)育潛能也越高。成體細胞中，卵丘細胞更適于做核移植的供體。G0/G1期對重組胚發(fā)育有利。G2期由于DNA已經合成，需再復制一次才能分裂，因而易產生多倍體子細胞。,東北師范大學,東北師范大學,供體細胞核與受體細胞質相互作用,核移植后,延長核質相互作用時間可促進核重塑及發(fā)育程序的重編程。G0與G1早期細胞此時DNA合成未開始，細胞活動緩慢，移入卵母細胞后需用較長時間從抑

9、制狀態(tài)恢復，這恰好利于卵母細胞質對移植核的再編程過程。,東北師范大學,干細胞治療,東北師范大學,干細胞治療的特點,僅需一次或幾次介入治療，影響長遠； 不需要完全了解疾病發(fā)生的確切機理；是最好的免疫治療和基因治療載體；成體干細胞不會誘發(fā)畸胎瘤的發(fā)生；自身干細胞移植無組織相容性的問題，可避免長期應用免疫抑制劑；不存在倫理學爭議。,東北師范大學,干細胞治療機理,替代修復死亡和受損的細胞組織。激活休眠和處于抑制狀態(tài)的細胞。發(fā)揮旁分

10、泌作用，釋放細胞因子，包括營養(yǎng)、生長及抗凋亡因子等。促進細胞間傳導能力，包括電刺激、電傳導、細胞連接、傳導通路重建、離子通道開放與介質釋放等。,東北師范大學,干細胞移植的安全性問題,除結果觀察外，移植后一般不易證實在靶器官中能否產生足夠的效應細胞。異源污染：是否能避免動物性污染。致癌性：干細胞體外培養(yǎng)擴增能否形成突變積累，干細胞有形成畸胎瘤的傾向。移植穩(wěn)定性：移植后的免疫排斥問題。,東北師范大學,不同組織細胞iPS的致瘤性差異,

11、山中伸彌等人用iPS方法將不同小鼠細胞誘導成神經細胞，植入小鼠腦部，觀察致畸胎瘤的能力。致瘤性最低:胃細胞來源的iPS（0%）。致瘤性較低：胚胎干細胞和胚胎成纖維細胞來源的iPS（8%）。致瘤性最高：鼠尾皮膚細胞iPS（83%）,東北師范大學,iPS神經細胞的致癌性,Rochester大學Steven Goldman將人ES用iPS法誘導成神經細胞，移植到滅活多巴胺分泌神經元大鼠的腦部，八周內動物的運動功能都得以恢復。然而，在移

12、植10周后發(fā)現(xiàn)，只有1/5的移植細胞產生多巴胺，其余正朝無法控制的腦瘤轉化。,東北師范大學,造血干細胞移植,歷史悠久，最成熟的移植技術；外周血造血干細胞移植恢復快，排異反應低于骨髓造血干細胞移植;臍帶血特別是胎盤造血干細胞移植，盡管成本較高但配型寬松，排異反應低，不需術后用藥等優(yōu)點，有望取代其它方式的移植。目前只有少數發(fā)達國家建有大型臍帶血庫。,Edward D Thomas,東北師范大學,造血干細胞生物學特性,高度自我更新及分化潛

13、能；非增殖狀態(tài)，95%以上處于G0期；缺乏系相關抗原；不對稱分裂方式；高度表達CD34和CDW90。,骨髓；1/400臍帶血；1/10000外周血；1/100000,東北師范大學,造血干細胞的分離,免疫吸附法（抗原和抗體特異性結合）,磁性標記CD34單克隆抗體,,加入供體外周血,,抗原和抗體特異性結合,,通過分選系統(tǒng),,,造血干細胞吸附到柱子上,其它細胞留在血液中,東北師范大學,人類白細胞抗原（HLA）配型,一類抗

14、原： HLA-A，HLA-B，HLA-C  二類抗原： HLA-D（DR、DQ、DP） 三類抗原： C4A，C4B，C2，Bf前兩類與移植排斥反應主要相關，其中對HLA-A、HLA-B和HLA-DR的等位基因檢測尤為重要。匹配度高成功率高。配型來源：親屬、父母、同胞、同卵雙生。干細胞庫(臍血、骨髓和外周血干細胞庫）可以很好解決排斥問題。,東北師范大學,造血干細胞移植治療

15、地中海貧血,患者：16列Ⅲ度重型B地貧患兒。供者：患者父或母，提供HLA單倍體相合外周血造血干細胞?；颊哳A處理：氟達拉濱+白消安+環(huán)磷酰胺+抗胸腺細胞抗體+全身照射；患者移植物抗宿主病(GVHD)預防:環(huán)孢素+甲氨蝶呤+霉酚酸酯供者預處理：G-CSF等，動員造血干細胞。4天后分離造血干細胞，立即輸給患者。5天和3個月后各重復一次。,東北師范大學,移植過程及移植后治療,干細胞輸注：輸注后次日給G-CSF， 至白細胞恢復正常后停用。

16、感染預防：預處理前一周入住凈化無菌病房；乙肝攜帶者藥物預防病毒復制；給予預防真菌與細菌感染、肺孢子蟲感染藥物，同時監(jiān)測血象和體征。支持治療：反應過重無法進食時輸營養(yǎng)液；血紅蛋白過低時輸紅細胞；血小板過低時輸血小板。,東北師范大學,移植后治療及結果檢測,肝靜脈栓塞VOD的治療：給予去纖苷移植物抗宿主病的治療：給予免疫抑制劑，嚴重者激素治療、CD25單抗(舒萊)，其它癥狀則對癥治療。植活及嵌合狀態(tài)檢測：分別在植入30天和90天進行熒

17、光原位雜交(FISH)測定骨髓造血細胞中的性染色體的細胞比例，或檢測短串聯(lián)重復序列(STR)。,東北師范大學,造血干細胞移植治療結果,造血功能重建情況：16例中14例成功植入，造血迅速重建。2例患者未能植入，其中l(wèi)例52天后恢復自體造血，另1例32天后死于重度GVHD。植活證據：30天后14例患者均為供者型完全嵌合狀態(tài)，90天后13例仍處于完全嵌合狀態(tài)，1例于第68天死于腸道重度GVHD。 1例廣泛型慢性GVHD，表現(xiàn)為全身硬皮病樣變

18、化，經藥物治療后癥狀緩慢減輕，37個月后仍存活。,東北師范大學,自體骨髓干細胞移植治療肝硬化,50位患者：肝硬化體征，包括納差、乏力、腹脹，腹水，生化指標符合。干細胞采集：穿刺抽取骨髓200ml，肝素抗凝，分離骨髓干細胞。干細胞移植：經股動脈穿刺插管至肝固有動脈，將干細胞懸液10ml于0.5 小時內經左右肝動脈緩慢注入。預防性給予抗菌藥物連續(xù)3天。,東北師范大學,骨髓干細胞分離,東北師范大學,骨髓獲取與肝部植入,東北師范大學,骨髓

19、干細胞移植治療結果,體征變化:移植后8周內腹水減輕41例，食欲改善例45例，腹脹減輕45例。血清生化指標變化：移植后14天出現(xiàn)好轉，28顯著好轉，56天總膽紅素顯著降低；膽固醇顯著升高；凝血酶原時間顯著縮短；白蛋白顯著升高，不用補充。不良反應：所有患者未出現(xiàn)嚴重不良反應。2例患者3個月后死于肝硬化所致消化道大出血。,東北師范大學,胚胎干細胞治療腦部疾病,霍普金斯大學研究小組將鼠胚胎干細胞由特定因子誘導后，植入“殘疾鼠 ”脊髓內。干細

20、胞在髓內定向成長為運動神經元，并在脊髓與腿部肌肉之間形成連接神經。經過6個月治療，15只癱瘓的老鼠中有11只獲得部分康復。目前干細胞移植治療小兒腦癱逐漸被人們所熟知。,東北師范大學,,帕金森氏癥parkinson's disease,中腦黑質多巴胺（dopamine, DA）能神經元的變性死亡，由此而引起紋狀體DA含量顯著性減少而引起的運動障礙。,東北師范大學,干細胞移植治療帕金森氏癥,東北師范大學,臍帶間充質干細胞治療帕金

21、森病,患者：50-78歲8例，Ⅲ~Ⅴ級。干細胞制備及鑒定：臍帶浸于含雙抗的PBS中運回。沖洗臍帶血管。將臍帶剪碎，加入消化液(含胰酶與膠原酶Ⅱ的PBS)，37 ℃中消化4 h，10 min振搖1次。將消化上清轉移到培養(yǎng)瓶中，加入DMEM/F12培養(yǎng)基（15%優(yōu)質胎牛血清)，每3 天半量換液擴增用流式儀檢測表面標志：CD29、CD44、 CD90、CD105的陽性率應在95%以上，CD34、CD45表達陰性。,東北師范大學,臍帶間充

22、質干細胞治療帕金森病,間充質干細胞移植：入院2周后進行頸動脈穿刺移植治療。在10 min內緩慢注入間充質干細胞注射液20 mL(4×107)，每周1次或再次。輔助治療：擴張血管、抗自由基、神經營養(yǎng)、穩(wěn)定細胞膜等藥物。評估標準：移植前和移植后1個月比對，采用該病統(tǒng)一評分標準評定。分為精神、行為和情緒、日?；顒?、運動功能、治療的并發(fā)癥。,東北師范大學,臍帶間充質干細胞移植治療結果,8例患者均移植成功，中途無脫落。治療有效：

23、對肌強直、震顫等癥狀改善顯著。與移植前相比專業(yè)評分有所降低，差異比較明顯。治療無效：對運動遲緩、體位不穩(wěn)等癥狀未見改善，主要可能是觀察期較短的原因。,東北師范大學,間充質干細胞治療帕金森病的可能機制,在腦部形成表達神經標志物的神經元樣細胞或星形膠質細胞。受中樞神經組織誘導分泌腦源性神經營養(yǎng)因子，刺激損傷部位產生內源性生長因子，促進損傷修復并減少凋亡。是受損部位新生血管的組成細胞，可分化成血管內皮細胞和細胞外基質。在腦內創(chuàng)建適宜的

24、局部微環(huán)境，替代受損細胞重建神經功能區(qū)和傳導通路。,東北師范大學,干細胞治療中風后遺癥,格拉斯哥大學研究人對９名缺血性中風患者實施干細胞治療，將神經干細胞注射到腦損傷部位，接受治療時已患病半年至５年，而中風超過半年的患者通常被認為很難康復。結果顯示，５名60-80歲患者的神經功能缺損癥狀持續(xù)緩解，其認知、平衡和運動能力均有所恢復，均未出現(xiàn)細胞及免疫方面的不良反應。,東北師范大學,出血性中風與缺血性中風,東北師范大學,骨髓干細胞移植治療

25、心肌梗死,持續(xù)性缺血、缺氧所引起的心肌壞死,東北師范大學,冠狀動脈狹窄與手術治療,東北師范大學,將自體骨髓干細胞通過冠狀動脈，移植到梗死或凋亡部位，會轉化成具有收縮功能的心肌細胞，解決由于心肌細胞數量減少引起的充血性心力衰竭問題，從而給心臟病患者帶來生機。,骨髓干細胞移植治療心肌梗死,東北師范大學,iPS方法治療心肌梗死,心肌梗死后成，為避免心臟破損，成纖維細胞迅速在受損部位形成瘢痕。中國學者提出假設，能否用iPS方法直接將瘢痕修復的

26、成纖維細胞轉化為心肌細胞，該設想發(fā)表于《醫(yī)學假設》。美國學者很快就在動物體外和體內試驗中證實該假設成立。將3種基因導入新近梗死的瘢痕組織，將成纖維細胞分化為心肌樣細胞。,東北師范大學,干細胞治療心血管疾病,2007年西班牙醫(yī)生成功地為一名67歲男性患者實施了世界首例心臟間充質干細胞移植術。接受治療的患者患有嚴重心絞痛和冠狀動脈損傷，搭橋和支架等療法均無效。醫(yī)生從患者腹部提取300克脂肪，從中分離間充質干細胞，再通過導管將其植入心臟

27、，病人術后情況良好。,東北師范大學,干細胞體外誘導胰島β細胞,胰島素釋放與血糖含量相關,移植動物血糖下降,Doug Melton Harvard University,東北師范大學,人干細胞來源的胰島β細胞在小腎小囊內形成胰島樣細胞團及的胰島素結晶顆粒。,東北師范大學,胰島素β細胞體外大規(guī)模培養(yǎng),東北師范大學,骨髓干細胞治療椎骨損傷,一名男子20年前頸部嚴重受傷，胸部以下全部癱瘓。 20年后，醫(yī)生將受損組織取走后，將

28、骨髓分離的干細胞填充至脊椎受損處。僅僅幾周時間，病人大腿慢慢有了知覺。一年以后，他的腿部、后背、腹部能夠使勁，并能控制上身活動，甚至可以扶著雙杠行走。,東北師范大學,先天性頜面部骨發(fā)育不全綜合征（Treacher Collin syndrome）治療方法：分離、培養(yǎng)自體脂肪干細胞，加入分化和生長因子、供體骨支架、骨包被組織等。,5號染色體長臂的5q31.3-q33.3內異常,東北師范大學,燒傷皮膚的傳統(tǒng)治療與干細胞治療,東北師范

29、大學,干細胞治療兒童皮膚燙傷,東北師范大學,澳洲學者成功利用干細胞技術，修復受損角膜。患者無須手術，只需戴上特制的隱形眼鏡，數周后就能重見光明。由于治療使用的是患者本身的干細胞，因此不會出現(xiàn)排斥。,,,干細胞附著在隱形眼鏡內壁,3周后受損角膜恢復,東北師范大學,表皮生長因子誘導脂肪干細胞轉變?yōu)槌衫w維細胞產生膠原，彈性蛋白及其它皮膚成分。,東北師范大學,脂肪干細胞美容術,東北師范大學,結果不確定的干細胞去皺美容術,東北師范大學,復習