惡性瘧多表位疫苗m.rcag1在大腸桿菌中的表達(dá)純化及穩(wěn)定溶液體系的篩選

1、碩士學(xué)位論文學(xué)校代碼： 1 0 0 2 3學(xué) ：知$ 2 0 0 9 2 4 2惡性瘧多表位疫苗M ．R C A g ．1 在大腸桿菌中的表達(dá)純化及穩(wěn)定溶液體系的篩選所 院：姓 名：指導(dǎo)教師：導(dǎo)師小組：學(xué)科專業(yè)：研究方向：完成日期：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院何學(xué)虎王恒教授病原生物學(xué)蛋白質(zhì)疫苗2 0 1 2 年5 月2 0 1 2 年5 月中國北京北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院碩t ：研究?！畚徽撐膼盒辕懠捕啾砦坏鞍滓呙鏜 。R C A g 一1 在大腸桿

2、菌中的表達(dá)純化及穩(wěn)定溶液體系的篩選何學(xué)虎( 中困醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)石j l ：究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，1 0 0 0 0 5 北京)中文摘要：瘧疾是當(dāng)今世界上對人類危害最嚴(yán)重的二大傳染性疾病之一，主要流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)。根據(jù)W H O 最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)估計(jì)，僅2 0 1 0 年全世界就有2 ．1 6 億瘧疾臨床病例，大約6 5 ．5 萬人囚其而死亡，2 0 1 0 年傘球有3 3 億人面臨感染瘧疾的風(fēng)險(xiǎn)，而且人多數(shù)為非洲撒哈拉以南

3、地區(qū)5 歲以卜兒童和孕婦。在感染人的5 種瘧原蟲中，惡性瘧原蟲是危害最嚴(yán)重、致死率最高的一種。近年來，盡管在瘧疾控制方面取得了顯著成效，但南于抗藥性惡性瘧原蟲蟲株和抗殺蟲劑蚊媒的產(chǎn)牛及蔓延，使得傳統(tǒng)瘧疾防治方法受到嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，這就加劇了人們對于預(yù)防性和治療性瘧疾疫苗的齋求。由于瘧原蟲生活史復(fù)雜，抗原表達(dá)具有期特異性、蟲株間差異性、蟲體問的高度變異性和逃避宿主免疫攻擊的機(jī)制等特點(diǎn)，基于單個(gè)抗原或表位的疫苗在相關(guān)實(shí)驗(yàn)中的免疫效果并不理想。兇此

4、，多期多價(jià)人工疫苗成為目前抗瘧疫苗的研究熱點(diǎn)。本課題組對惡性瘧原蟲多表位疫茁的研制進(jìn)行了長期的探索，前期利用表位改組技術(shù)構(gòu)建了多表位基因庫，并用庫免疫血清篩選出了免疫原性最佳、穩(wěn)定性最好的隨機(jī)組合多表位人工抗原M ．R C A g —l ，最終獲得了原核表達(dá)的高效工程菌。M ．R C A g ．1 與佐劑乳化后免疫小鼠和新西蘭大白兔，結(jié)果顯示其具有較強(qiáng)的免疫原性，特異性抗體在體外可抑制瘧原蟲生長( G r o w t hI n h i

5、b i t i o n A s s a y , G I A ) 。表明M ．R C A g ．1 可作為惡性瘧原蟲紅內(nèi)期候選疫苗，迸一步優(yōu)化、開發(fā)。但是，由丁- 初步放大生產(chǎn)所獲得的重組蛋白量較低，而日．其存一8 0 。C 保存幾周后會出現(xiàn)降解或聚集，給后續(xù)研究帶來了困難。因此，獲得高純度穩(wěn)定的M ．R C A g 一1 重組蛋白是臨床前研究的關(guān)鍵步驟。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，根據(jù)多表位嵌合抗原疫苗M ．R C A g —l 的理化性

6、質(zhì)，利用鎳親和層析、陰離。r 交換層析和凝膠過濾層析等不同組合方式的5 種純化方案對其進(jìn)行純化，根據(jù)最終純度和回收率選擇最佳純化方案，摸索m 了多表位嵌合抗原疫苗M ．R C A g ．1 的純化步驟。與此同時(shí)，選用了蛋白結(jié)晶試劑盒C r y s t a l S c r e e nH Tf H R 2 —1 3 0 ) 中的溶液與M ．R C A g —l 蛋白液混合，通過倒置顯微鏡觀察和1 2 ％S D S ．P A G E 電泳圖譜