Ⅱb類細菌素PlnJ和PlnK的異源表達和抗菌活性研究.pdf

1、細菌素是人類研究較為深入的微生物防御物質，具有種類多樣，來源豐富，無毒高效等特點。隨著化學防腐劑的泛濫和抗生素耐藥病原菌的出現(xiàn)，安全高效的細菌素在食品防腐、醫(yī)療保健以及動物飼料行業(yè)具有巨大的潛力。到目前為止，只有nisin一種細菌素被商業(yè)化應用于食品防腐行業(yè)，且存在抑菌譜窄，只能抑制部分革蘭氏陽性菌的缺陷。因此開發(fā)其他廣域抑菌的細菌素就非常有必要。
　　本文的實驗對象是Ⅱb類細菌素PlnJ/K，其中多肽PlnJ含有25個氨基酸，多

2、肽PlnK含有32個氨基酸。當這兩個不同的多肽協(xié)同作用時，抑菌活性將明顯增強。本實驗室篩選得到一株具有廣譜抗菌性的植物乳桿菌ZJ316，在其全基因組序列中的植物乳桿菌素基因簇中發(fā)現(xiàn)細菌素基因plnJ和plnK，并在大腸桿菌中成功地表達這兩個基因。通過一系列的分離純化得到目標蛋白，并對目標蛋白進行了初步的抗菌活性研究。具體內容如下:
　　1)設計plnJ和plnK基因合成序列，在兩個基因的5'端添加一個腸激酶酶切位點，目的是為了表達

3、目標蛋白后，用腸激酶酶切，能得到未經任何修飾的成熟肽PlnJ和PlnK。
　　2)設計引物，對合成基因plnJ和plnK進行PCR擴增，將擴增產物與表達載體pET-32a進行KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切，構建pET-32a-plnJ和pET-32a-plnK重組表達質粒。將重組質粒轉化至表達菌株BL21(DE3)中，通過IPTG誘導表達，SDS-PAGE驗證重組蛋白pET-32a-PlnJ和pET-32a-PlnK被順利誘導。

4、　　3)為減少包涵體的產生，將重組表達菌株BL21-pET-32a-plnJ和BL21-pET-32a-plnK在1 mM IPTG，16℃，160 rpm的條件下過夜誘導表達，菌體超聲破碎后離心收集上清。
　　4)超聲破碎上清為含有組氨酸標簽的融合蛋白pET-32a-PlnJ和pET-32a-PlnK的粗提液，通過鎳柱吸附融合蛋白，利用咪唑與組氨酸標簽競爭鎳柱的結合位點，洗脫得到的融合蛋白即為純度較高的重組蛋白，脫鹽濃縮后，利用

5、BCA蛋白濃度測定試劑盒測定重組蛋白的濃度，分別為880μg/mL和720μg/mL。腸激酶酶切得到兩種蛋白PlnJ和PlnK，分子量的大小分別為2.9 kDa和3.5 kDa，用10 kDa超濾離心管離心收集分子量小的蛋白，即濾液中含有目標蛋白PlnJ和PlnK。
　　5)對分離得到的目標蛋白PlnJ和PnK進行抑菌活性研究，指示菌為大腸桿菌和單增李斯特菌，采用牛津杯雙層平板抑菌法和96孔板抑菌法。在雙層平板抑菌法中，單獨的Pl