膜聯(lián)蛋白A3在乳腺癌增殖及侵襲轉(zhuǎn)移中作用的研究.pdf

1、乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年上升，在歐美國家乳腺癌占女性惡性腫瘤的25％～30%。在我國，乳腺癌發(fā)病率已上升為女性惡性腫瘤第一位。了解乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制對(duì)有效治療乳腺癌，從而提高患者生存率有重要意義。因此，找到與乳腺癌診斷、分期和治療相關(guān)的特異性生物學(xué)標(biāo)志是一項(xiàng)重要的工作。
　　膜聯(lián)蛋白家族（Annexin，ANX）屬于Ca(2+)調(diào)節(jié)的磷脂和膜結(jié)合蛋白，在細(xì)胞中參與膜轉(zhuǎn)運(yùn)及膜表面一系列依賴于鈣調(diào)蛋白的活

2、動(dòng)，并調(diào)控炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化和細(xì)胞骨架蛋白間的相互作用。ANX表達(dá)失調(diào)與人類疾病相關(guān)，其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中可介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)通路、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成、細(xì)胞凋亡及抗藥性有關(guān)。家族成員膜聯(lián)蛋白A3(Annexin A3，ANXA3)在腫瘤的形成、增殖、凋亡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)形成過程中都扮演著重要角色，ANXA3表達(dá)水平的改變，對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥性有重要影響。然而，ANXA3在不同腫瘤中的表達(dá)模式不同，提示ANXA3在不同腫瘤

3、發(fā)生發(fā)展中可能起不同作用。如ANXA3表達(dá)上調(diào)與卵巢癌的耐藥性、結(jié)直腸癌和胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展以及肺腺癌、肝癌的轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)性；而ANXA3表達(dá)水平下調(diào)則表現(xiàn)為促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展。因此，ANXA3可能成為腫瘤治療的靶標(biāo)，是一種潛在的與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及患者預(yù)后相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物。然而， ANXA3在乳腺癌中的表達(dá)、功能及作用機(jī)制仍不十分清楚。
　　本研究分四部分對(duì)ANXA3在乳腺癌增殖及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制進(jìn)行研究

4、：
　　第一部分：通過免疫組化Max Vision TM一步法檢測(cè)原發(fā)性乳腺癌組織中ANXA3的表達(dá)情況，回顧性分析ANXA3與患者臨床生物學(xué)特性的相關(guān)性。
　　第二部分：通過應(yīng)用熒光定量RT-PCR法、western-blot技術(shù)檢測(cè)乳腺癌組織及正常乳腺組織中ANXA3 mRNA及蛋白表達(dá)水平，分析其與臨床生物學(xué)特性的關(guān)系；采用流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)乳腺癌組織及正常乳腺組織細(xì)胞周期，分析乳腺癌組織中ANXA3mRNA及蛋白表達(dá)

5、水平與細(xì)胞增殖指數(shù)的相關(guān)性，旨在探討ANXA3在乳腺癌發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用。
　　第三部分：采用 RNA干擾技術(shù)抑制乳腺癌 MDA-MB-231細(xì)胞ANXA3基因表達(dá)，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移能力；Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲能力，旨在探討ANXA3對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖及侵襲的影響。
　　第四部分：建立乳腺癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，通過繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線、應(yīng)用活體成像技術(shù)、HE

6、染色分析、流式細(xì)胞術(shù)及熒光定量RT-PCR等方法觀察抑制ANXA3對(duì)移植瘤生長(zhǎng)的影響。
　　第一部分乳腺癌組織中膜聯(lián)蛋白A3表達(dá)與其臨床生物學(xué)特性關(guān)系的研究
　　目的：本研究通過免疫組化Max Vision TM一步法檢測(cè)原發(fā)性乳腺癌組織中膜聯(lián)蛋白A3(Annexin A3, ANXA3)的表達(dá)情況，分析ANXA3與患者臨床生物學(xué)特性的相關(guān)性，探討ANXA3在乳腺癌診治中的臨床價(jià)值。
　　方法：收集2009年1月至20

7、09年12月河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院乳腺中心收治的、經(jīng)病理確診且有完整隨訪資料的309例原發(fā)性乳腺癌患者石蠟包埋組織標(biāo)本。入選病例均為女性，年齡22-76歲，中位年齡為47歲。通過免疫組化Max Vision TM一步法檢測(cè)原發(fā)性乳腺癌組織中ANXA3的表達(dá)情況，分別將患者按照年齡（<50歲145例、≥50歲164例）、月經(jīng)狀況（絕經(jīng)前158例、絕經(jīng)后151例）、腫瘤大?。ā?cm117例、>2cm且≤5cm160例、>5cm32例）、淋巴

8、結(jié)轉(zhuǎn)移（無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移129例、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)1~3枚108例、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)>3枚72例）、臨床TNM分期（Ⅰ期54例、Ⅱ期221例、Ⅲ期34例）、組織學(xué)分級(jí)（Ⅰ級(jí)35例、Ⅱ級(jí)192例、Ⅲ級(jí)82例）、分子亞型（Luminal A型65例、Luminal B型148例、HER2過表達(dá)型37例、三陰性59例）進(jìn)行分組，分析ANXA3與上述臨床生物學(xué)特性的相關(guān)性。所有病例均由乳腺中心進(jìn)行電話隨訪，隨訪時(shí)間截止至2015年6月，計(jì)算患者無病生存期（DF

9、S）及總生存期（OS）。采用COX回歸模型進(jìn)行多因素分析，觀察ANXA3及各臨床生物學(xué)特性與患者預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移1~3枚組和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移>3枚組ANXA3陽性表達(dá)率分別是51.94%，67.59%，73.61%，三組間陽性表達(dá)率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.123，P<0.05）。
　　2.根據(jù)術(shù)后病理組織學(xué)分級(jí)，分為Ⅰ級(jí)組、Ⅱ級(jí)組、Ⅲ級(jí)組ANXA3陽性表達(dá)率分別是31.42

10、%，65.10%，69.51%，三組間ANXA3陽性表達(dá)率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=16.686，P<0.05）。
　　3.ANXA3表達(dá)水平與年齡、月經(jīng)狀況、腫瘤大小及臨床TNM分期無關(guān)（P>0.05）。Luminal A型、Luminal B型、HER2過表達(dá)型、三陰性型ANXA3陽性表達(dá)率分別是58.46%，58.11%，59.46%，79.66%，ANXA3在三陰性乳腺癌患者中陽性表達(dá)率（79.66%）明顯高于其他類型（χ

11、2=9.226，P<0.05）。
　　4.截止至2015年6月，309例患者隨訪時(shí)間為66~78個(gè)月，中位隨訪時(shí)間71個(gè)月。71個(gè)月DFS為68.93%（213/309），死亡58例，71個(gè)月OS為81.23%（251/309），采用COX回歸模型進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量和ANXA3表達(dá)水平則被分別認(rèn)定為影響DFS和OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，兩者對(duì)DFS的相關(guān)危險(xiǎn)度分別為2.181和1.569，對(duì)OS的相關(guān)危險(xiǎn)度分別是2.

12、052和1.698。
　　結(jié)論：
　　1.ANXA3表達(dá)水平與乳腺癌患者年齡、月經(jīng)狀況、腫瘤大小及臨床TNM分期無關(guān)。
　　2.ANXA3表達(dá)水平與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量、組織學(xué)分級(jí)及分子分型有關(guān)，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移>3枚、組織分化Ⅲ級(jí)及三陰性乳腺癌患者中陽性表達(dá)率提高。
　　3.ANXA3陽性表達(dá)者DFS低于陰性表達(dá)者，兩者間OS的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但ANXA3陽性表達(dá)者OS有降低趨勢(shì)。
　　4.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量和

13、ANXA3表達(dá)水平則被分別認(rèn)定為影響乳腺癌患者DFS和OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　5.ANXA3可作為潛在判斷乳腺癌生物學(xué)行為、指導(dǎo)判斷患者無病生存期及總生存期的生物學(xué)標(biāo)志物。
　　第二部分：膜聯(lián)蛋白A3mRNA及蛋白在正常乳腺組織及乳腺癌組織中的表達(dá)及意義
　　目的：分析膜聯(lián)蛋白A3(Annexin A3，ANXA3)mRNA及蛋白在正常乳腺組織及不同分化程度乳腺癌組織中的表達(dá)，探討ANXA3在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中

14、的作用及意義。
　　方法：選取河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院乳腺中心2015年4月至2015年10月資料完整的乳腺癌組織標(biāo)本81例，患者均為女性，年齡29~80歲，中位年齡50歲。依照第三版WHO制定的病理分類方案，術(shù)后病理：浸潤性導(dǎo)管癌66例、浸潤性小葉癌4例、浸潤性導(dǎo)管-小葉混合癌2例，篩狀癌1例、分泌性癌1例，導(dǎo)管內(nèi)癌7例；依照2010年AJCC第7版TNM分期，Ⅰ期11例、Ⅱ期50例、Ⅲ期19例、IV期1例；于常規(guī)取材時(shí)，在距癌灶>

15、7cm處隨機(jī)切取乳腺組織0.5cm×0.5cm大小，并經(jīng)病理診斷證實(shí)為正常腺體組織，作為對(duì)照組。采用熒光定量RT-PCR法檢測(cè)乳腺癌組織及正常乳腺組織中ANXA3 mRNA水平；利用western-blot技術(shù)檢測(cè)乳腺癌組織及正常乳腺組織中ANXA3蛋白表達(dá)水平；分析乳腺癌組織中ANXA3 mRNA和蛋白表達(dá)水平與年齡、月經(jīng)狀況、臨床分期、腫瘤大小、病理組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、分子分型等臨床生物學(xué)指標(biāo)的關(guān)系。采用流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)乳

16、腺癌組織及正常乳腺組織細(xì)胞周期，比較乳腺癌組織與正常乳腺組織細(xì)胞增殖指數(shù)及ANXA3 mRNA及蛋白表達(dá)水平與細(xì)胞增殖指數(shù)的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1.乳腺癌組織中ANXA3 mRNA水平（0.0667±0.0314）顯著高于正常乳腺組織中ANXA3 mRNA水平（0.0273±0.0268）（P<0.01）。ANXA3蛋白在乳腺癌組織中表達(dá)水平（0.68±0.10）顯著高于在乳腺正常組織中的表達(dá)（0.25±0.07）（P

17、<0.01）。
　　2.乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量>3個(gè)者ANXA3 mRNA水平（0.0815±0.0306）顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（0.0577±0.0363），亦高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量1~3個(gè)者（0.0733±0.0030）（P<0.05）。有脈管瘤栓者ANXA3 mRNA水平（0.0841±0.0321）高于無脈管瘤栓者（0.0607±0.0232）（P<0.05）。乳腺癌組織中ANXA3 mRNA及蛋白表達(dá)水平均與年齡、月經(jīng)狀

18、況、臨床TNM分期、腫瘤大小及組織學(xué)分級(jí)無關(guān)（P>0.05）。
　　3.三陰性乳腺癌患者ANXA3 mRNA水平（0.0943±0.0281）高于Luminal A型者（0.0627±0.0185）、Luminal B型者（0.0631±0.0301）、HER2過表達(dá)者（0.0647±0.0434）（P<0.05）。乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量>3個(gè)者ANXA3蛋白表達(dá)水平（0.76±0.09）顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（0.65±0.0

19、8）、亦高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量1~3個(gè)者（0.68±0.12）（P<0.05），有脈管瘤栓者ANXA3蛋白表達(dá)水平（0.71±0.10）高于無脈管瘤栓者（0.65±0.09）（P<0.05），三陰性乳腺癌患者ANXA3蛋白表達(dá)水平（0.81±0.06）高于Luminal A型者（0.64±0.10）、Luminal B型者（0.67±0.10）、HER2過表達(dá)者（0.69±0.13）（P<0.05）。
　　4.乳腺癌組織G0/1期細(xì)胞

20、為(58.85±9.32)%， S期細(xì)胞為（20.09±13.16）%，G2/M期細(xì)胞為（21.06±13.69）%；正常乳腺組織G0/1期細(xì)胞為(82.52±3.86)%，S期細(xì)胞為（6.57±5.37）%，G2/M期細(xì)胞為（10.91±5.70）%。與正常乳腺組織相比，乳腺癌組織G0/1期細(xì)胞顯著降低(P<0.01)。乳腺癌組織細(xì)胞增殖指數(shù)(41.15±9.32)%較正常乳腺組織細(xì)胞增殖指數(shù)(17.48±3.86)%顯著增高（P<0

21、.01）。
　　5.乳腺癌組織中ANXA3 mRNA及蛋白表達(dá)水平與細(xì)胞增殖指數(shù)呈正相關(guān)性，(Pearson相關(guān)系數(shù)=0.304，P=0.006；Pearson相關(guān)系數(shù)=0.341， P=0.002)。
　　結(jié)論：
　　1.乳腺癌組織中ANXA3 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著高于正常乳腺組織。
　　2.乳腺癌組織中ANXA3mRNA及蛋白表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)有關(guān)，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量>3個(gè)組表達(dá)最高；有脈管瘤栓者A

22、NXA3mRNA及蛋白表達(dá)水平高于無脈管瘤栓者；三陰性乳腺癌ANXA3mRNA及蛋白表達(dá)水平高于其他分子分型。
　　3.乳腺癌組織中ANXA3 mRNA及蛋白表達(dá)水平與細(xì)胞增殖指數(shù)呈正相關(guān)性。
　　4.乳腺癌組織中ANXA3mRNA及蛋白表達(dá)水平與患者年齡、月經(jīng)狀況、腫瘤大小及臨床TNM分期、病理組織學(xué)分級(jí)無關(guān)。ANXA3可能參與并促進(jìn)了乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及增殖、轉(zhuǎn)移的過程。
　　第三部分：膜聯(lián)蛋白A3對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖

23、及侵襲影響的研究
　　目的：本部分以乳腺癌細(xì)胞株為研究對(duì)象進(jìn)一步觀察乳腺癌細(xì)胞株中膜聯(lián)蛋白A3(Annexin A3，ANXA3)表達(dá)及抑制ANXA3表達(dá)后乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲能力的改變，探討ANXA3在乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲中的作用機(jī)制。
　　方法：選取高侵襲性人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231及低侵襲性人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，熒光定量RT-PCR檢測(cè)MDA-MB-231及MCF-7細(xì)胞中ANXA3

24、 mRNA水平；western-blot方法檢測(cè)MDA-MB-231及MCF-7細(xì)胞中ANXA3蛋白表達(dá)水平。選擇高表達(dá)ANXA3的MDA-MB-231細(xì)胞株進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。成功構(gòu)建了3個(gè)針對(duì)ANXA3基因的shRNA質(zhì)粒，經(jīng)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ANXA3-sh2對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中 ANXA3mRNA抑制效率最高。篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞命名為MDA-MB-231-Sh，轉(zhuǎn)染NC質(zhì)粒的細(xì)胞命名為MDA-MB-231

25、-NC。實(shí)驗(yàn)分為三組觀察：轉(zhuǎn)染組為轉(zhuǎn)染ANXA3-sh2質(zhì)粒的MDA-MB-231-Sh，空轉(zhuǎn)組為轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒的MDA-MB-231-NC，對(duì)照組為未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的MDA-MB-231。western-blot方法檢測(cè)三組ANXA3蛋白表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移能力；Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲能力。
　　結(jié)果：
　　1.MDA-MB-231細(xì)胞ANXA3 mRNA相對(duì)

26、表達(dá)量(0.0696±0.0248)與MCF-7細(xì)胞ANXA3 mRNA相對(duì)表達(dá)量(0.0236±0.0149)相比顯著增高（P<0.01）。MDA-MB-231細(xì)胞ANXA3蛋白相對(duì)表達(dá)量（0.76±0.02）顯著高于MCF-7細(xì)胞中ANXA3蛋白相對(duì)表達(dá)量（0.40±0.02）（P<0.01）。
　　2.轉(zhuǎn)染組（MDA-MB-231-Sh）細(xì)胞中ANXA3蛋白表達(dá)量顯著低于空轉(zhuǎn)組（MDA-MB-231-NC）及對(duì)照組（MDA-

27、MB-231）細(xì)胞中的表達(dá)量（P<0.01）。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖周期結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組（MDA-MB-231-Sh）中G0/1期細(xì)胞為(59.27±0.87)%，S期細(xì)胞為（24.73±1.68）%， G2/M期細(xì)胞為（15.93±1.15）%；空轉(zhuǎn)組（MDA-MB-231-NC）細(xì)胞中G0/1期細(xì)胞為(53.63±1.80)%，S期細(xì)胞為（31.60±2.17）%，G2/M期細(xì)胞為（14.08±0.35）%；對(duì)照

28、組（MDA-MB-231）細(xì)胞中G0/1期細(xì)胞為(52.40±2.91)%，S期細(xì)胞為（34.60±3.56）%，G2/M期細(xì)胞為（13.00±1.48）%。轉(zhuǎn)染組（MDA-MB-231-Sh）細(xì)胞G0/1期顯著高于空轉(zhuǎn)組（MDA-MB-231-NC）及對(duì)照組（MDA-MB-231）細(xì)胞 G0/1期（P<0.05）。MDA-MB-231-Sh細(xì)胞增殖指數(shù)（Proliferation Index, PI）(40.67±0.93)%顯著低于

29、MDA-MB-231-NC(46.40±1.85)%及MDA-MB-231細(xì)胞PI值(47.60±2.91)%（P<0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組（MDA-MB-231-Sh）細(xì)胞凋亡率(6.73±0.33)%顯著高于空轉(zhuǎn)組（MDA-MB-231-NC）(3.58±0.23)%及對(duì)照組（MDA-MB-231）細(xì)胞(3.09±0.33)%（P<0.01）。
　　4.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染組（MDA-MB-23

30、1-Sh）細(xì)胞遷移能力低于空轉(zhuǎn)組（MDA-MB-231-NC）及對(duì)照組（MDA-MB-231）細(xì)胞。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染組（MDA-MB-231-Sh）細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)少于空轉(zhuǎn)組（MDA-MB-231-NC）及對(duì)照組（MDA-MB-231）細(xì)胞。
　　結(jié)論：
　　1.高侵襲性人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231中ANXA3 mRNA及蛋白表達(dá)水平均高于低侵襲性人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7。
　　2.成功構(gòu)建了3個(gè)

31、針對(duì)ANXA3基因的shRNA質(zhì)粒，其中H_ANXA3-sh2轉(zhuǎn)染效率最高，抑制ANXA3效果最好。
　　3.通過抑制ANXA3表達(dá)MDA-MB-231細(xì)胞細(xì)胞凋亡率顯著升高而細(xì)胞增殖指數(shù)顯著降低，侵襲、遷移能力下降。ANXA3亦有可能成為一個(gè)可用于乳腺癌診斷、治療和預(yù)后評(píng)估的潛在的生物學(xué)標(biāo)志物。
　　第四部分：膜聯(lián)蛋白A3對(duì)乳腺癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)影響的研究
　　目的：建立乳腺癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，觀察抑制膜

32、聯(lián)蛋白A3(Annexin A3，ANXA3)表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響，進(jìn)而驗(yàn)證ANXA3對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的調(diào)控作用。
　　方法：使用第三部分實(shí)驗(yàn)中制備的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231、MDA-MB-231-sh及MDA-MB-231-NC，建立荷瘤裸鼠動(dòng)物模型。將18只裸鼠隨機(jī)分為3組，每組6只，接種MDA-MB-231細(xì)胞者為對(duì)照組；接種MDA-MB-231-NC細(xì)胞者為空轉(zhuǎn)組；接種MDA-MB-231-sh細(xì)胞者

33、為轉(zhuǎn)染組。自皮下移植瘤開始生長(zhǎng)起持續(xù)觀察4周，記錄三組裸鼠的精神、飲食及排便情況，每周測(cè)量一次裸鼠的體重及皮下種植瘤的長(zhǎng)、短徑，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。應(yīng)用活體成像技術(shù)檢測(cè)皮下移植瘤活性程度。HE染色分析三組移植瘤組織結(jié)構(gòu)。采用流式細(xì)胞術(shù)及熒光定量RT-PCR檢測(cè)裸鼠皮下移植瘤的細(xì)胞增殖周期及ANXA3 mRNA水平，記錄并比較上述指標(biāo)在三組裸鼠間的差異。
　　結(jié)果：
　　1.三組裸鼠分別接種MDA-MB-231、MDA-MB-2

34、31-NC及MDA-MB-231-Sh細(xì)胞后，10d左右開始成瘤，成瘤率達(dá)100%。
　　2.生長(zhǎng)曲線顯示：轉(zhuǎn)染組裸鼠皮下移植瘤較對(duì)照組及空轉(zhuǎn)組生長(zhǎng)緩慢?；铙w成像技術(shù)檢測(cè)顯示：轉(zhuǎn)染組移植瘤生長(zhǎng)活性低于對(duì)照組及空轉(zhuǎn)組。轉(zhuǎn)染組皮下移植瘤質(zhì)量及體積[(58.55±31.92)mg及(90.62±74.44) mm3]與對(duì)照組[(222.40±133.40)mg及(239.30±110.90) mm3]及空轉(zhuǎn)組[(239.30±110.9

35、0)mg及(406.72±95.23) mm3]相比，皮下移植瘤質(zhì)量及體積顯著降低， P<0.01。
　　3.HE染色顯示：對(duì)照組及空轉(zhuǎn)組皮下移植瘤組織細(xì)胞豐富，核分裂象多見，瘤組織中有豐富的血管；轉(zhuǎn)染組皮下移植瘤細(xì)胞稀疏，有大量纖維結(jié)締組織增生，瘤組織間血管較少。
　　4.轉(zhuǎn)染組裸鼠皮下移植瘤細(xì)胞中ANXA3 mRNA水平（0.0071±0.0021）顯著低于對(duì)照組（0.0671±0.0087）及空轉(zhuǎn)組（0.0698±0.

36、0104），P<0.01。轉(zhuǎn)染組裸鼠皮下移植瘤細(xì)胞中ANXA3蛋白表達(dá)水平（0.26±0.02）顯著低于對(duì)照組（0.72±0.04）及空轉(zhuǎn)組（0.71±0.06），P<0.01。
　　5.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組G0/1期細(xì)胞為（73.84±3.92）%， S期細(xì)胞為（5.57±1.60）%，G2/M期細(xì)胞為（20.41±4.85）%；對(duì)照組G0/1期細(xì)胞為（57.43±2.60）%，S期細(xì)胞為（23.15±2.29）%，G

37、2/M期細(xì)胞為（19.41±1.39）%；空轉(zhuǎn)組G0/1期細(xì)胞為（57.57±2.97）%，S期細(xì)胞為（23.63±3.79）%，G2/M期細(xì)胞為（18.81±1.94）%。轉(zhuǎn)染組裸鼠皮下移植瘤細(xì)胞增殖指數(shù)（26.17±3.92）%顯著低于對(duì)照組（42.57±2.60）%及空轉(zhuǎn)組（42.43±2.97）%，P<0.01，而轉(zhuǎn)染組G0/1期細(xì)胞顯著高于對(duì)照組及空轉(zhuǎn)組，P<0.01。
　　結(jié)論：
　　1.抑制MDA-MB-231

38、細(xì)胞ANXA3表達(dá)后，可使轉(zhuǎn)染組裸鼠皮下移植瘤較對(duì)照組及空轉(zhuǎn)組生長(zhǎng)緩慢，且皮下移植瘤質(zhì)量及體積顯著降低，活性程度降低；HE染色下觀察轉(zhuǎn)染組皮下移植瘤細(xì)胞稀疏，有大量的纖維結(jié)締組織增生，瘤組織間血管較少。
　　2.轉(zhuǎn)染組裸鼠皮下移植瘤細(xì)胞中ANXA3 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組及空轉(zhuǎn)組。
　　3.轉(zhuǎn)染組裸鼠皮下移植瘤細(xì)胞增殖指數(shù)較對(duì)照組及空轉(zhuǎn)組顯著降低，而G0/1期細(xì)胞顯著升高。
　　4.沉默乳腺癌MDA-MB