沉默DNA甲基轉(zhuǎn)移酶上調(diào)NDRG1表達對前列腺癌DU145細胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的：
　　通過沉默 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶上調(diào) NDRG1基因，探討其對前列腺癌 DU145細胞生物學(xué)行為的影響。
　　方法：
　　1.收集天津市泌尿外科研究所保存的12例行根治性前列腺切除術(shù)患者的前列腺癌組織及12例行根治性膀胱切除術(shù)或經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)患者的良性前列腺增生組織標(biāo)本，通過免疫組織化學(xué)染色及RT-qPCR方法檢測組織中DNMT1、DNMT3b及NDRG1的表達情況，并對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　2.體

2、外培養(yǎng)前列腺癌細胞系 DU145、PC-3及人正常前列腺上皮細胞系RWPE-1，通過RT-qPCR、Western blot方法檢測細胞系中DNMT1、DNMT3b及NDRG1的表達情況，并對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　3．參照相關(guān)資料設(shè)計DNMT1-siRNA、DNMT3b-siRNA及其陰性對照序列（ negative control， NC），分別轉(zhuǎn)染 DNMT1-siRNA、DNMT3b-siRNA、DNMT1-siRNA+

3、DNMT3b-siRNA至DU145細胞，同時設(shè)置陰性對照（NC control）及空白對照（Control）。通過RT-qPCR、Western blot方法檢測細胞中DNMT1、DNMT3b和NDRG1基因表達改變。通過CCK8檢測細胞增殖情況，Muse細胞狀態(tài)分析儀檢測細胞凋亡情況，劃痕實驗檢測細胞遷移能力，Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力，并對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。篩選出NDRG1表達提升及細胞生物學(xué)行為改變最顯著組DU

4、145細胞進行下一步實驗。
　　4.參照相關(guān)資料設(shè)計NDRG1-siRNA及其陰性對照序列，將NDRG1-siRNA轉(zhuǎn)染至上述NDRG1表達提升最顯著組的DU145細胞，同時設(shè)置陰性對照及空白對照。通過RT-qPCR、Western blot方法檢測細胞中NDRG1基因表達改變，并進行細胞增殖能力、細胞凋亡情況、細胞遷移及侵襲能力檢測，最后對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組化及RT-qPCR結(jié)果顯示，D

5、NMT1、DNMT3b在前列腺癌組織中的表達高于前列腺增生組織（P<0.05），NDRG1在前列腺增生組織中的表達高于前列腺癌組織（P<0.05）。
　　2.通過RT-qPCR及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，DNMT1、DNMT3b在DU145、PC-3細胞系中的表達高于RWPE-1細胞系（P<0.05），且DNMT1、DNMT3b在DU145細胞系中的表達高于PC-3細胞系（P<0.05）；NDRG1在RWPE-1細胞系中的

6、表達高于DU145、PC-3細胞系（P<0.05）。
　　3.將DU145細胞分為5組進行轉(zhuǎn)染后，通過RT-qPCR、Western blot、CCK8細胞增殖實驗、Muse細胞狀態(tài)分析儀檢測細胞凋亡、細胞劃痕實驗和Transwell侵襲實驗等檢測發(fā)現(xiàn)，DNMT1-siRNA、DNMT3b-siRNA可顯著抑制DNMT1、DNMT3b的mRNA和蛋白表達（P<0.05），顯著提升NDRG1的mRNA和蛋白表達（P<0.05），顯著

7、抑制細胞增殖（P<0.05），促進細胞凋亡（P<0.05），減弱細胞的遷移和侵襲能力（P<0.05）。其中DNMT1-siRNA組效果最顯著，共轉(zhuǎn)染未見顯著協(xié)同效應(yīng)（P>0.05）。
　　4.轉(zhuǎn)染DNMT1-siRNA至DU145細胞24h后，將這些細胞分為3組再次進行轉(zhuǎn)染。通過RT-qPCR、Western blot、CCK8細胞增殖實驗、Muse細胞狀態(tài)分析儀檢測細胞凋亡、細胞劃痕實驗和 Transwell侵襲實驗等檢測發(fā)現(xiàn)，

8、 NDRG1-siRNA可顯著抑制NDRG1的mRNA和蛋白表達（P<0.05），顯著促進細胞增殖（ P<0.05），減少細胞凋亡（ P<0.05），增強細胞的遷移和侵襲能力（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.DNMT1、DNMT3b在前列腺癌細胞中高表達，在正常前列腺細胞中低表達；NDRG1在前列腺癌細胞中低表達，在正常前列腺細胞中高表達。
　　2.NDRG1在前列腺癌細胞中發(fā)揮抑癌基因的作用，可以抑制前列腺癌細