快速檢測EGFR基因突變的方法和裝置研究.pdf

1、目的
　　1.建立一種能集核酸提取、擴(kuò)增和檢測為一體的微流控芯片裝置。
　　2.設(shè)計(jì)出一組具有高特異性和高敏感性的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)引物。
　　3.基因檢測在肺癌個(gè)體化醫(yī)療中的作用越來越受到重視，尤為值得關(guān)注的是EGFR基因突變的檢測。我們希望綜合利用等位基因特異性擴(kuò)增、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP，65℃)和玻璃粉吸附核酸的方法，研制一個(gè)使用簡易、方便攜帶、快速、高特異性和敏感性的基因突變檢測微流控芯片(micr

2、ofluidic chip)結(jié)合篩選出來的一組引物來檢測表皮生長因子受體(EGFR)的突變情況。
　　對象與方法
　　1.利用FreeHand矢量繪圖軟件繪制出設(shè)計(jì)出的能集核酸提取、擴(kuò)增和檢測為一體的微流控芯片裝置。
　　2.利用從中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞中心獲取的H-1975細(xì)胞系（含有EGFR L858R點(diǎn)突變）和A-549細(xì)胞系（不含有相關(guān)EGFR突變）作為篩選環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)特異、敏感引物的底物。

3、r>　　3.結(jié)合利用微流控芯片的可設(shè)計(jì)性，設(shè)計(jì)了間距50μm微縫隙，阻止吸附核酸的玻璃粉流出反應(yīng)室，同時(shí)設(shè)計(jì)氣囊和不同容納小室，擠壓氣囊盛放等溫?cái)U(kuò)增緩沖液。在本芯片結(jié)構(gòu)上，對兩種細(xì)胞株（EGFR L858R陽性基因突變細(xì)胞株H1975和相應(yīng)陰性未突變細(xì)胞株A549）的DNA提取物進(jìn)行等位基因LAMP引物的特異性和敏感性驗(yàn)證;并且利用鈣黃綠素與LAMP副產(chǎn)物焦磷酸鎂反應(yīng)顯綠色的現(xiàn)象，直接肉眼就看到突變的樣本變?yōu)榫G色，未突變的還保持黃色。并

4、利用這個(gè)芯片體系對臨床病理標(biāo)本進(jìn)行EGFR基因突變檢測。
　　結(jié)果
　　1.設(shè)計(jì)制作出的微流控芯片裝置在預(yù)先加入能吸附核酸的玻璃粉和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)緩沖液和顯色劑前提下，能很好的鍵合。并且玻璃粉吸附核酸、LAMP擴(kuò)增和鈣黃綠素結(jié)合焦磷酸鎂顯色的能力能很好地使基因的提取、擴(kuò)增和檢測集為一體。
　　2.微流控芯片的微縫隙可以成功阻止吸附了DNA的玻璃粉流出反應(yīng)室，使得提取組織、細(xì)胞的DNA變得快速方便而不需要離心

5、機(jī)等任何大型儀器。另一方面，微流控芯片的設(shè)計(jì)將LAMP反應(yīng)緩沖液和顯色液預(yù)先加載在芯片小室中，并利用氣囊擠壓的優(yōu)勢，在檢測時(shí)可一次性將緩沖液加入到反應(yīng)室，避免了LAMP易污染的問題。篩選出的等位基因特異性LAMP引物可以在25分鐘內(nèi)高特異性、高敏感性地?cái)U(kuò)增出有EGFR L858R點(diǎn)突變的靶序列的樣本，并利用預(yù)先加入的鈣黃綠素肉眼可見地檢測出突變樣本。最后在98例肺癌患者中成功檢測出5例有EGFR L858R突變的肺腺癌患者樣本。

6、　　結(jié)論
　　隨著個(gè)體化醫(yī)療在全世界范圍的逐步展開，報(bào)道了許多檢測肺癌EGFR基因突變的方法，這些方法有基于PCR的、基于測序的、基于探針的等等，這其中有些方法比直接測序法更準(zhǔn)確，但是都需要借助大型儀器進(jìn)行檢測(PCR儀、電泳儀、熒光顯微鏡等)也需要消耗大量時(shí)間。我們展示的微流控裝置可以快速、特異、敏感的檢測出基因突變，而且經(jīng)濟(jì)效益高，方便使用也方便發(fā)放給使用者，符合WHO提出的診斷檢測裝置的要求，對基因突變篩查有非常好的應(yīng)用前景