骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對胰島移植物的保護(hù)作用.pdf

1、胰島移植自2000年來已成為治療不穩(wěn)定性胰島素依賴型糖尿病的重要手段，同時(shí)這也給移植領(lǐng)域帶來了新的研究方向。不同于其它終末期疾病所進(jìn)行的器官移植，胰島移植的目的更注重改善患者的生存質(zhì)量，所以更理想的方法是誘導(dǎo)移植免疫耐受狀態(tài)，即在不使用免疫抑制劑的情況下，維持同種異體移植物功能良好，同時(shí)保持機(jī)體對其它外來抗原正常的宿主反應(yīng)。因此，如何誘導(dǎo)同種異體胰島移植物的免疫耐受成為臨床胰島移植研究發(fā)展的方向。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone

2、Marrow Mesenchymal Stem Cells，BM-MSCs）有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用，可通過分泌多種可溶性分子或通過其與免疫細(xì)胞的相互接觸等途徑抑制抗原特異性或非特異性的淋巴細(xì)胞增殖，抑制抗原提呈細(xì)胞的分化、成熟，誘導(dǎo)抗原特異性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（T regulatory cell，Treg）的形成，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答向抗炎癥方向偏移，在器官移植、替代治療等領(lǐng)域具有巨大的臨床應(yīng)用價(jià)值。有研究表明：間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合胰島移植可提高胰島移

3、植物存活時(shí)間，調(diào)節(jié)胰島移植物免疫耐受，其作用機(jī)制與細(xì)胞接觸或其分泌的細(xì)胞因子有關(guān)，但因BM-MSCs功能復(fù)雜，目前暫無統(tǒng)一定論。亦有研究表明：濾泡輔助性T細(xì)胞（T follicular helper cell，Tfh）作為獨(dú)立分化來源的新CD4+T細(xì)胞亞群，已在多項(xiàng)研究中證實(shí)其在自身免疫性疾病、移植免疫與腫瘤免疫等多方面起到重要的調(diào)節(jié)作用，但是否參與I型糖尿病發(fā)生發(fā)展尚未可知？因此，我們考慮Tfh細(xì)胞是否參與I型糖尿病的發(fā)生發(fā)展？BM-

4、MSCs是否通過調(diào)節(jié)Tfh細(xì)胞的分化水平從而調(diào)節(jié)免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，起到對胰島移植物的保護(hù)作用？本實(shí)驗(yàn)就以上問題進(jìn)行了初步研究。首先在Gotoh胰島分離技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，使得胰島分離過程更為簡單和有效；同時(shí)采用全骨髓培養(yǎng)法分離BM-MSCs細(xì)胞并通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行鑒定，為BM-MSCs聯(lián)合胰島移植提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上，建立非肥胖糖尿病鼠（Non-obese Diabetic mice，NOD）胰島移植動(dòng)物模型，研究了不同BM-MS

5、Cs聯(lián)合胰島移植方案的效果，且初步研究BM-MSCs對Tfh細(xì)胞的調(diào)控作用，旨在說明MSC是否通過調(diào)節(jié)Tfh細(xì)胞而起到移植胰島保護(hù)作用。
　　第一部分：小鼠胰島的分離與純化
　　目的：探討C57BL/6小鼠胰島分離、純化的較優(yōu)方案，并評價(jià)分離所得胰島的生物學(xué)特性。
　　方法：小鼠麻醉開腹后，于胰管十二指腸開口處逆行插入24G套管針，先慢后快地注入3mL胰腺消化液，分離胰腺組織，經(jīng)消化、洗滌、過篩后使用Histopaqu

6、e-1077溶液與Hanks溶液進(jìn)行梯度離心，取兩溶液中間界面胰島組織于培養(yǎng)皿中，顯微鏡下篩選。篩選后的胰島經(jīng)雙硫腙（DTZ）染色鑒定胰島細(xì)胞，AO/PI染色法鑒定胰島細(xì)胞活性，葡萄糖刺激試驗(yàn)檢測胰島細(xì)胞胰島素分泌功能，ELISA法檢測胰島素水平。
　　結(jié)果：經(jīng)鏡下篩選后每只小鼠純化后獲得的胰島數(shù)為195.00±14.95 IEQ/只，純度>90.00％；雙硫腙（DTZ）染色后胰島細(xì)胞團(tuán)呈現(xiàn)猩紅色，AO/PI染色后顯示，分離的胰島

7、細(xì)胞團(tuán)內(nèi)活細(xì)胞比例超過95.00%；胰島素分泌功能檢測結(jié)果為，高糖刺激下，分離的胰島釋放胰島素含量（23.00±3.90 ng.ml-110islet-1.45min-1）為低糖濃度（10.10±1.40 ng.ml-110islet-1.45min-1）刺激下的2倍以上，說明分離胰島具有較高的胰島素釋放能力。
　　結(jié)論：胰管十二指腸開口處逆行插管進(jìn)行消化液灌注與傳統(tǒng)的膽總管插管灌注相比可降低因膽管走形較長而出現(xiàn)的刺破膽總管風(fēng)險(xiǎn)，

8、提高手術(shù)成功率，Histopaque-1077溶液與Hanks溶液進(jìn)行密度梯度離心操作簡單，提高了實(shí)驗(yàn)效率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)分離的胰島功能良好，可用于各項(xiàng)胰島相關(guān)實(shí)驗(yàn)。
　　第二部分：小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　目的：探索小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSCs）原代分離培養(yǎng)方法，鑒定BM-MSCs的生物學(xué)特性并為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。
　　方法：小鼠消毒處理后分離雙側(cè)股骨及脛骨，抽取骨髓腔內(nèi)骨髓于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，

9、每日于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量等生長情況。取指數(shù)期生長的BM-MSCs細(xì)胞，以CD29、CD117、CD44、CD31、Sca-1為細(xì)胞特異性標(biāo)記進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測鑒定。
　　結(jié)果：每只小鼠平均BM-MSCs獲得率為（5.35±0.40）×105個(gè)/只，細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞特異性表達(dá)CD29（陽性率96.04%）、CD44（陽性率96.21%）及Sca-1（陽性率95.72%），不表達(dá)CD117（陽性率0.13%）及CD3

10、1（陽性率0.23%）。
　　結(jié)論：全骨髓培養(yǎng)法分離小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞操作較為簡單，BM-MSCs獲得率高，培養(yǎng)后細(xì)胞狀態(tài)良好，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　第三部分：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對同種異體胰島移植物的保護(hù)作用及機(jī)制
　　目的：研究BM-MSCs聯(lián)合胰島移植對胰島移植物的保護(hù)作用，及BM-MSCs對Tfh的調(diào)節(jié)作用并誘導(dǎo)胰島移植免疫耐受的機(jī)制。
　　方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共分為5組。A組（Group A）NOD正常血

11、糖組（非手術(shù)組）；B組（Group B）糖尿病組（非手術(shù)組）；C組（Group C）單純胰島移植組；D組（Group D）胰島細(xì)胞與BM-MSCs共同移植組；E組（Group E）BM-MSCs尾靜脈注射+BM-MSCs/胰島聯(lián)合移植組。手術(shù)方式為腎包膜下胰島移植，移植術(shù)后檢測血糖變化，術(shù)后第7天行糖耐量檢測。取術(shù)后第7天各組小鼠脾臟及外周血行ELISA法檢測各組中糖尿病自身抗體GAD65Ab、IAA表達(dá)水平，流式細(xì)胞儀檢測各組外周血及

12、脾臟Tfh細(xì)胞水平，Western blot發(fā)檢測ICOS及Bcl-6表達(dá)水平，取移植處腎臟組織行HE染色，免疫組化及免疫熒光染色，觀察移植物形態(tài)及胰島素分泌情況。
　　結(jié)果：D組（23.67±2.77天）和E組（34.00±4.51天）受鼠平均生存時(shí)間較C組（11.67±2.27天）明顯延長；C、D、E組受鼠分別從第14.0天、26.0天及42.0天開始表現(xiàn)為移植胰島功能失活，差異顯著；術(shù)后第2天C組出現(xiàn)明顯低血糖（3.5±1.

13、3 mmol/L），而D組（6.5±1.4 mmol/L）和E組（7.1±1.4 mmol/L）血糖仍在正常范圍（5.0~20.0 mmol/L）內(nèi)；術(shù)后第7天糖耐量檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三個(gè)移植組較糖尿病組均有較好的血糖控制，而血糖峰值D組（18.4±0.9 mmol/L）和E組（18.0±0.7 mmol/L）較C組（21.8±1.3 mmol/L）血糖控制更穩(wěn)定，D組和E組兩組之間血糖控制差異不顯著；受體血清中糖尿病自身抗體GAD65

14、（A:0.40±0.02;B:1.49±0.03；C:1.20±0.09；D:0.82±0.03；E:0.42±0.03 OD450nm）及IAA（A:0.31±0.03;B:1.31±0.06；C:1.03±0.07；D:0.70±0.04；E:0.32±0.03 OD450nm）水平差異顯著，CD4+CXCR5+Tfh細(xì)胞比例分別為A組（4.35±1.54%）、B組（24.55±5.41%）、C組（23.87±6.67%）、D組（9

15、.67±1.34%）及E組（4.27±0.59%），Western blot檢測ICOS及Bcl-6表達(dá)D組和E組較B組和C組明顯降低，差異顯著；三手術(shù)組移植物病理學(xué)檢測結(jié)果顯示：與C組合D組相比，E組胰島移植物形態(tài)更為完整，胰島融合不明顯，淋巴細(xì)胞侵潤較少，胰島素分泌水平較高。
　　結(jié)論：BM-MSCs通過調(diào)節(jié)Tfh細(xì)胞比例，降低體內(nèi)糖尿病自身抗體水平，從而起到誘導(dǎo)胰島移植免疫耐受的效果，對胰島移植物起到保護(hù)作用；且BM-MSC