姜黃提取物對SK-N-SH細胞缺氧損傷保護的機理研究.pdf

1、目的:在我國,近年來隨著科技的進步以及我國人口老齡化進程的不斷發(fā)展,非感染性疾病正越來越嚴重地危害國人健康,其中腦血管病的多發(fā),使得血管性癡呆(Vascular Dementia,VD)的發(fā)病率迅速增加,并且血管性癡呆發(fā)病率隨著年齡增加而直線上升,所以VD越來越受到人們的關(guān)注。由于VD是腦血管病后的主要并發(fā)癥,不僅給患者本人帶來長期的痛苦,嚴重的影響其生活質(zhì)量,而且也給整個家庭和社會造成沉重的負擔。
　　 目前國內(nèi)外關(guān)于VD的治

2、療,尚無特效療法。現(xiàn)代醫(yī)學主要是通過降低腦血管病的危險因素,對于臨床有腦血管病危險因素的患者,進行早期一級預(yù)防,以預(yù)防腦血管病和VD的發(fā)生。對于已發(fā)生VD的患者,除積極治療腦血管病外,常給予鈣離子拮抗劑、抗自由基藥物、膽堿酯酶抑制劑、控制行為和精神癥狀等藥物,以延緩病情發(fā)展,緩解其癥狀,提高患者的生活質(zhì)量。因此充分發(fā)揮中醫(yī)藥整體觀念,辨證論治特色優(yōu)勢,將對血管性癡呆治療具有重要意義。
　　 本研究課題是在導師王四平教授的指導下,

3、依據(jù)中醫(yī)基礎(chǔ)理論,通過細胞生物學實驗研究,以連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)損傷人神經(jīng)母細胞瘤SK-N-SH細胞為神經(jīng)細胞缺氧損傷模型,以從姜黃中提取的姜黃提取物結(jié)晶體(包括姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙脫甲氧基姜黃素)對SK-N-SH細胞損傷保護及凋亡的影響,探討姜黃的有效部位——姜黃提取物對SK-N-SH細胞缺氧損傷的保護作用;并探討其治療血管性癡呆的機理,為臨床用藥提供理論根據(jù)。
　　 方法:
　　 本實驗采用的是細胞生

4、物學方法,實驗時共分五組,分別為:對照組、模型組、20μmol·L-1姜黃提取物組(低劑量組)、40μmol·L-1姜黃提取物組(中劑量組)、80μmol·L-1姜黃提取物組(高劑量組)。各給藥組預(yù)保護1h,后加入連二亞硫酸鈉(Na2S2O4),均給予缺氧損傷處理。使其終濃度為5mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)8h、16h、24h,進行細胞形態(tài)觀察;利用MTT比色法檢測不同培養(yǎng)時間細胞存活率;乳酸脫氫酶(LDH)活性測定;分光光度法檢測細胞培養(yǎng)液

5、內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量;并應(yīng)用Western blotting方法檢測細胞Caspase-3活性變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.形態(tài)學觀察倒置相差顯微鏡下觀察各組SK-N-SH細胞生長及形態(tài)的變化。
　　 結(jié)果顯示:倒置顯微鏡下SK-N-SH細胞形狀呈圓形,橢圓形,梭形,不規(guī)則形,較少有突起,且圓形較多,為貼壁細胞,折光性較強,生長速度較快,培養(yǎng)3d后細胞生長成簇。SK-N-SH細胞

6、在5 mmol/LNa2S2O4作用下有明顯的損傷,鏡下可見細胞數(shù)目減少,突起消失,腫脹圓縮,折光性下降,貼壁能力降低,細胞胞體逐漸減小,胞體內(nèi)顆粒逐漸增多,可以看到大部分細胞已經(jīng)死亡,部分細胞裂解成碎片;給予姜黃提取物各組均能明顯減輕缺氧環(huán)境下的SK-N-SH細胞形態(tài)學的變化,表現(xiàn)為細胞折光性較好,細胞碎片形成減少,細胞胞體逐漸增大,胞體內(nèi)顆粒逐漸減少。
　　 2.MTT法細胞存活力測定
　　 結(jié)果顯示:各組細胞培養(yǎng)8

7、h的OD值分別為:對照組0.77±0.03、模型組0.12±0.01、低劑量組0.22±0.01、中劑量組0.27±0.01、高劑量組0.34±0.03;各組16h的OD值分別為:對照組0.83±0.04,模型組0.19±0.01、低劑量組0.25±0.01、中劑量組0.31±0.01、高劑量組0.41±0.02;各組24h的OD值分別為:對照組1.13±0.04、模型組0.19±0.01、低劑量組0.25±0.01、中劑量組0.34±

8、0.01、高劑量組的為0.44±0.03。姜黃提取物三個劑量(20μmol·L-1、40μmol·L-1、80μmol·L-1)組的OD值較模型組明顯增高,與模型組比較有顯著性差異(P＜0.01)。
　　 3.乳酸脫氫酶(LDH)活性測定
　　 結(jié)果顯示:各組LDH值分別為:對照組370.61±35.96U/L、模型組1000.77±16.78 U/L、低劑量組735.52±44.0 U/L、中劑量組571.31±37.

9、00U/L、高劑量組467.34±91.23 U/L。姜黃提取物三個劑量(20μmol·L-1、40μmol·L-1、80μmol·L-1)中的LDH漏出量明顯減少,與模型組比較有顯著性差異(P＜0.01),抑制了LDH的釋放,并且是隨著劑量的增加LDH的釋放逐漸減少,與劑量呈負相關(guān)。
　　 4.姜黃提取物對SK-N-SH細胞缺氧損傷后細胞外SOD、MDA的影響
　　 結(jié)果顯示,各組SOD值分別為:對照組14.62±0.

10、41 U/L、模型組10.62±0.43U/L、低劑量組12.86±0.30 U/L、中劑量組13.71±0.27 U/L、高劑量組13.99±0.38 U/L。各組MDA值:對照組3.39±0.33U/L、模型組6.11±1.04U/L、低劑量組4.08±0.63/L、中劑量組3.79±0.42U/L、高劑量組3.63±1.15U/L。與正常對照組相比,模型組細胞培養(yǎng)液內(nèi)的MDA水平均明顯升高(P＜0.01)、而細胞培養(yǎng)液內(nèi)的SOD水

11、平均明顯下降(P＜0.01);與模型組組相比,姜黃提取物低、中、高濃度組均可使SK-N-SH細胞培養(yǎng)液內(nèi)的MDA水平均明顯降低(P＜0.01)、而使細胞培養(yǎng)液的SOD水平均明顯升高(P＜0.01),結(jié)果顯示:姜黃提取物能夠抑制SK-N-SH細胞的缺氧損傷。
　　 5.姜黃提取物對缺氧誘導SK-N-SH損傷模型細胞Caspase-3活性的影響:
　　 通過Western blot檢測法檢測Caspase-3蛋白的表達情況:

12、與正常對照組相比,連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)誘導組細胞Caspase-3活性升高;與連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)誘導組相比,姜黃提取物低、中、高濃度組均可使SK-N-SH細胞Caspase-3活性下降。
　　 結(jié)論:
　　 1、姜黃提取物對SK-N-SH細胞的缺氧損傷具有保護作用。
　　 2.姜黃提取物對SK-N-SH細胞缺氧損傷的保護作用是通過抑制凋亡和抗氧化作用實現(xiàn)的。
　　 3、為姜黃提取物治